НЕОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ, 2015, том 51, № 10, с. 1098-1104
УДК 666.3-12;546.41
О ВЛИЯНИИ АМИНОКИСЛОТЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ ЧАСТИЦ ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ НА МАКРОМОЛЕКУЛАХ ХИТОЗАНА
© 2015 г. И. В. Фадеева*, А. С. Фомин*, А. А. Синельников**, Ю. Г. Колягин***, С. М. Баринов*
*Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук, Москва
**Воронежский государственный университет ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова е-шаП: fadeeva_inna@mail.ru Поступила в редакцию 27.11.2014 г.
Проведено исследование, направленное на создание новых минерал-полимерных композитов для восстановления поврежденной костной ткани после обширных хирургических операций и травм. Получены материалы на основе хитозана и фосфатов кальция, методом ЯМР 13С установлено их вероятное строение.
БО1: 10.7868/80002337X15100061
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время значительное внимание исследователей уделяется разработке композиционных материалов на основе фосфатов кальция и биополимеров, в частности коллагена [1]. Но в связи с тем, что коллаген — продукт животного происхождения, он может являться переносчиком патогенных факторов от животных к человеку; следовательно, его использование в медицине нежелательно. Поэтому были предприняты попытки использовать в композиционных материалах другой полисахарид — хитозан.
Хитозан является природным биополимером, встречающимся в природе в виде ацилированной формы — хитина — в панцирях ракообразных, а также в покровных тканях некоторых насекомых. По своему строению этот природный полисахарид напоминает целлюлозу и крахмал, с той разницей, что одна из гидроксильных групп вторичного гид-роксила замещена на ацилированную аминогруппу. В результате проведения реакции деацетилиро-вания из хитина образуется хитозан, растворимый в кислотах [2]. Из всех аминокислот (АК) только две — аспарагиновая и глутаминовая — являются кислыми и, следовательно, способны образовывать соединения с хитозаном — аспартат и глутамат хитозония соответственно [3]. Поэтому в качестве объектов исследований выбраны аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Из всех низкотемпературных фосфатов кальция наибольший интерес для нас представляют дикальцийфосфат дигидрат (СаНР04 ■ 2Н20, ДКФД) с соотношением Са/Р, равным 1, и прекурсор гидроксиапатита — аморфный фосфат кальция с соотношением Са/Р, рав-
ным 1.5 (Ca3(PO4)2 ■ xH2O, АФК). Оба соединения являются метастабильными и подвергаются в организме трансформации, конечным продуктом которой является гидроксиапатит (ГА), основной минеральный компонент костной ткани человека.
Целью настоящей работы являлось получение материалов на основе хитозана и фосфатов кальция и установление их вероятного строения с использованием метода ЯМР.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез фосфатов кальция проводили in situ в присутствии хитозана высокомолекулярного (молекулярная масса 482 кДа, Aldrich) и аспарагино-вой или глутаминовой АК. Первоначально растворяли хитозан (от 0.25 до 2 г) в 100 мл водного раствора АК, взятой в количестве, равном по массе хитозану. Затем к образовавшемуся водному раствору аспартата или глутамата хитозония добавляли 40 мл раствора нитрата кальция концентрации 1 моль/л. Через 30 мин перемешивания на магнитной мешалке при температуре 37°С добавляли 40 мл раствора двухзамещенного фосфата аммония концентрации 1 моль/л. Значение рН поддерживали на уровне 5.5 ± 0.1 добавлением раствора аммиака. Уравнение реакции осаждения фосфата кальция может быть представлено схемой
Ca( NO3) 2 + ( NH4) 2HPO4 + + 2H2O ^ CaHPO4 • 2H2O + 2NH4NO3.
(1)
После добавления фосфата аммония происходило образование осадка белого цвета, который отделяли фильтрованием на воронке Бюхнера и
промывали дистиллированном водой до отрицательной реакции на ион аммония (проба с реактивом Неслера). Сушили полученные продукты на воздухе при комнатной температуре, после чего проводили дезагрегирование путем просеивания через сетку с размером ячейки 96 мкм.
Для соотношения Са/Р, равного 1.5, синтез проводили аналогично, различие состояло в значении рН, которое поддерживали на уровне 7 добавлением раствора аммиака. Взаимодействие реагентов проходило по реакции
3Ca( NO3 )2 + 2 ( NH4 )2HPO4 + 2NH4OH + + (n - 2)H2O ^ Ca3(PO4)2 • xH2O + 6NH2NO3.
(2)
Рентгенофазовый анализ проводили с помощью рентгеновского дифрактометра Shimadzu 6000 в режиме на отражение с использованием СиК"а-излучения. ИК-спектры регистрировали на образцах в виде таблеток с бромидом калия в интервале 400—4000 см-1 на спектрометре FTIR Avatar. Микроструктуру полученных соединений исследовали методом сканирующей электронной микроскопии на микроскопе Tescan Vega II, а также методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Эксперименты по ПЭМ проводили на микроскопах ЕМБ-100БР и ПРЭМ-200. Пробы для анализа готовили следующим образом: на основе каждого из исследуемых порошков готовили суспензию в дистиллированной воде (хорошо смачивающей порошок жидкости) методом ультразвукового диспергирования. Полученную суспензию наносили на тонкую (30 нм) углеродную пленку и после высыхания растворителя проводили исследования.
Твердотельные спектры ЯМР ВМУ 13С были получены на спектрометре ЯМР AVANCE-II NMR 400 фирмы BRUKER с частотами 400.1 и 100.4 МГц для ядер 1Н и 13С соответственно. Для регистрации спектров использовался двухканаль-ный твердотельный датчик с системой ВМУ (вращение под "магическим" углом) с внешним диаметром ротора 4 мм. Образец в виде порошка помещался в ВМУ-роторы из ZrO2. Во время регистрации спектров образец вращался со скоростью 10 кГц. Спектры ЯМР ВМУ на ядрах 13С регистрировались с использованием методики переноса поляризации с линейно убывающим импульсом по ядрам 1Н во время переноса поляризации [4, 5] и высокомощной развязкой SW-TPPM (т = 8 мкс, ф = 15°) по протонам во время регистрации спектра [6]. Время контакта составляло 2 мс, время между сканами — 1.5 с, время 90-градусного импульса по 1Н — 2.5 мкс. В качестве внешнего стан-
дарта шкалы химических сдвигов использовался кристаллический адамантан [7, 8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом РФА установлено, что структура фосфатов кальция, полученных в присутствии молекул хитозана и АК при рН 7 и соотношении Са/Р 1.5, соответствует АФК Са3(Р04)2 • хИ20. При соотношении Са/Р 1.67 и рН 9 происходит формирование так называемого осажденного ГА, соответствующего такой же формуле Са3(Р04)2 • хИ20.
Анализ ИК-спектров полученных соединений показал наличие полос, отнесенных к колебаниям фосфатных групп и воды. Дублет при 601 и 564 см-1 относится к колебаниям фосфатных групп и характерен для фосфатов кальция со структурой витло-кита ф-трикальцийфосфат (ТКФ)). Интенсивный пик при 1032 см-1 и полосы при 962 и 875 см-1 также относятся к колебаниям фосфатных групп [9].
Широкая полоса при 3245 см-1 и полоса при 1638 см-1 относятся к колебаниям молекул воды. Спектры соединений, содержащих аспарагиновую и глутаминовую кислоты, подобны, незначительные отличия наблюдаются в положении полос, отнесенных к колебаниям молекул воды и фосфатных групп. Спектр аспарагиновой кислоты содержит полосы при 1504 см-1, отнесенные к колебаниям аминогруппы. Смещение данной полосы к 1550 см-1 свидетельствует о протонировании аминогруппы и образовании аспартата хитозония.
Из сравнения спектров ЯМР аспарагиновой кислоты, хитозана и продукта их взаимодействия на основании смещения химических сдвигов и изменения ширины полос (рис. 1) сделан вывод, подтверждающий факт образования химического соединения аспартата хитозония. При введении в раствор аспартата хитозония раствора нитрата кальция не отмечено химического взаимодействия между катионами хитозония и кальция. При дальнейшем добавлении в полученный раствор двухза-мещенного фосфата аммония образовывался осадок, который после фильтрования и промывания водой также исследовали методом ЯМР-спектро-скопии.
Были получены и изучены спектры двух соединений, содержащих 70 и 30 мас. % ДКФД. В спектрах с более высоким содержанием ДКФД отсутствуют сигналы от атомов углерода, принадлежащих аспарагиновой кислоте, из чего можно сделать вывод об отсутствии аспартат-ионов в образовавшемся соединении. Из анализа спектров ЯМР также следует, что хитозан присутствует в исследуемом соединении в двух формах - молекулярной и ионной. Поэтому компенсировать положительный заряд иона хитозония в данной
ppm
200 180 160 140120 100 80 60 40 20 0 ppm
200 180160 140120 100 80 60 40 20 0 ppm
Рис. 1. ЯМР-спектры хитозана (а), аспарагиновой кислоты (б), соединения хитозана с аспарагиновой кислотой (в).
системе может только фосфат-ион с образованием фосфата хитозония.
В соединениях с меньшим содержанием ДКФД весь хитозан находится в ионной форме, а именно, в виде аспартата хитозония, что подтверждается идентичностью спектров исследуемого образца и аспартата хитозония. Сигналы от всех атомов углерода более широкие по сравнению с вышеописанным спектром, что объясняется меньшей степенью упорядоченности атомов углерода в системе.
При анализе общей морфологии образцов по изображениям, полученным с помощью ПЭМ (рис. 2, 3), установлено, что в целом размер и форма частиц неорганической фазы зависят от вида АК незначительно; тем не менее, можно заметить, что в присутствии аспарагиновой кислоты
частицы имеют анизотропную форму (рис. 2а, 2в, рис. 3а, 3в). При более детальном анализе установлено, что при значениях рН 7 на электроно-граммах проявляются рефлексы, которые могут быть отнесены к двум фазам — ГА и а-ТКФ. Основной фазой является фаза ГА; при этом частицы фазы а-ТКФ крупные, а подавляющее большинство на-нокристаллов относится к фазе ГА как следует из ширины дифракционных колец (рис. 2б, 2г). Кроме того, проведен анализ участков с дифракционной картиной (рис. 2б, 2г), на которых удалось обнаружить соответствие фазам ГА и а-ТКФ.
При повышении значения рН при синтезе с 7 до 9 и увеличении соотношения Са/Р от 1.5 до 1.67 наблюдаются следующие изменения: на элек-тронограммах исчезают рефлексы фазы а-ТКФ;
Рис. 2. ПЭМ-изображения и электронограммы образцов с соотношением Са/Р = 1.5, рН 7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.