ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 8, с. 1026-1031
ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^
МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 579.2525
О ВОЗМОЖНОЙ ВЗАИМОСВЯЗИ СИГМА S СУБЪЕДИНИЦЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ С СИСТЕМОЙ АЗОТНОГО КОНТРОЛЯ
У Pseudomonas chlororaphis
© 2007 г. О. Б. Астаурова, И. А. Басс, И. А. Хмель
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182; факс: (495) 196-02-21; e-mail: khmel@img.ras.ru Поступила в редакцию 21.11.2006 г.
Исследовано влияние мутации в гене rpoS, кодирующем сигма S субъединицу РНК-полимеразы, на способность клеток Pseudomonas chlororaphis 449 к ассимиляции ряда источников азота. Показано, что у мутантных клеток, несущих нокаутированный ген rpoS, способность использовать источники азота (аланин, пролин, гистидин, аргинин, мочевину, аммоний) значительно снижена, а активность глутаминсинтетазы в бесклеточных экстрактах подавлена. Оба дефекта исчезают при введении в среду роста глутамина. Предполагается, что у Pseudomonas chlororaphis существует взаимосвязь системы азотного контроля и системы регуляции экспрессии генов, обусловленной сигма S субъединицей РНК-полимеразы, что может способствовать адаптации клеток в условиях истощения источников азота.
Различные клеточные процессы бактерий управляются регуляторными системами, важную роль в которых играют белки, обеспечивающие специфичность транскрипции генов (сигмы-субъ-единицы РНК-полимеразы S, N, D и т.д.). При наступлении неблагоприятных условий сигма S субъединица РНК-полимеразы, кодируемая геном rpoS, активирует синтез нескольких десятков белков при переходе клеток в стационарную фазу и при различных шоковых воздействиях, что способствует выживанию клеток в этих условиях. Экспрессия многих генов, зависящих от сигмы S, индуцируется голоданием, которое обычно предшествует наступлению стационарной фазы [1, 2]. Ген rpoS описан у ряда псевдомонад. У Pseudomonas chlororaphis он секвенирован [3]. Другой системой, участвующей в адаптации бактерии к неблагоприятным условиям и, в частности, к голоду по азоту, является система азотного контроля (NTR, nitrogen regulation), разработанная в основном на энтеробактериях Б. Магазаником [4, 5] и действующая как на транскрипционном, так и на физиологическом уровне. Универсальными донорами аминогрупп в клетке являются глутамин и глутамат. NTR контролирует биосинтез глутамина и глутамата и экспрессию оперонов диссимиляции ряда азот-содержащих веществ, что необходимо для пополнения в клетке запасов глутамата и аммония. Образование глутамата происходит при аминировании а-кетоглутарата и осуществляется двумя путями. Первый, действующий при значительных концентрациях аммония (20 мМ и выше), осуществляется ферментом глутаматде-гидрогеназой (GDH), второй, функционирующий
при недостатке аммония (1 мМ), - путем сопряженного действия глутаминсинтетазы (GS) и глу-таматсинтазы (GOGAT).
Активация экспрессии оперонов GS и оперонов диссимиляции азотистых веществ выполняется при участии субъединицы РНК-полимеразы сигмы N, кодируемой геном rpoN, и ряда регуля-торных белков - продуктов генов, входящих в оперон GS (NRI, NRII, PII, UR), взаимодействие которых при недостатке аммония приводит к фосфорилированию белка NRI (каскадная регуляция). Этот белок присоединяется к энхансеру и взаимодействует с несущей сигму N РНК-полиме-разой, что приводит к открытию транскрипционного комплекса и началу инициации транскрипции. На физиологическом уровне азотная регуляция осуществляется посредством изменения активности самой глутаминсинтетазы, которая является сенсором системы и регулируется посредством модификации рядом эффекторов, в том числе и путем аденилирования [6].
Элементы системы NTR описаны у ряда представителей псевдомонад. Показано, в частности, что у них существует сигма N и что важную роль в регуляции играет GS [7-11], а мутации по rpoN и GS затрагивают биосинтез GDH и ферментов утилизации нитрата, мочевины, аланина, глицина, изолейцина, лейцина, серина, лизина [12]. Кроме системы NTR у псевдомонад в азотном контроле участвует также двухкомпонентная контрольная система CbrA-CbrB. Мутанты по этой системе не могут использовать некоторые аминокислоты (аргинин, гистидин и пролин), а
также некоторые источники углерода, например, глюкозу и цитрат [13].
Получены только косвенные доказательства взаимосвязи системы азотного контроля и зависящей от сигмы S регуляции экспрессии генов при переходе клеток в стационарную фазу у псевдомонад [14]. Целью настоящей работы было выяснение вопроса о том, существует ли такая взаимозависимость у P. chlororaphis. Для того чтобы проверить, влияет ли повреждение гена rpoS на систему азотного контроля, был сконструирован штамм P. chlororaphis 449 с нокаутированным геном rpoS. Сравнивали рост культур и активность ферментов GS, гистидазы и уреазы у исходного и мутантного штаммов в условиях избытка и дефицита аммония, используя в качестве источников углерода глюкозу и цитрат.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды, среды. В работе использовали штамм P. chlororaphis 449 (выделен к.б.н. Сорокиной Т.А., Институт молекулярной генетики РАН, из ризосферы кукурузы в Киевской области, Украина). Штамм Escherichia coli XL-1 Blue endAl gyrA96 hsdR17 lacF [proAB+ laqIq ZAM15Tn10(Tetr)] recAl relAl supE44 thi-1 получен из лабораторной коллекции. Штамм E. coli S17-1 (X-pir) thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tcr::Mu) (Kmr::Tn7) получен от д-ра Чернина Л.С. (Израиль).
В работе использовали следующие плазмиды: pBluescript SK(+), вектор для клонирования, Apr (Stratagene); плазмида pEX18Tc, вектор для замещения генов, Tcr oriT+ sacB, получена от д-ра Чер-нина Л.С. (Израиль).
Культуру P. chlororaphis 449 при проведении опытов по азотному контролю выращивали на минимальной среде М9 [15], но без аммония. В качестве источников азота использовали глицин, ги-стидин, аланин, пролин, аргинин, серин, глутамин, мочевину (по 20 мМ), KNO3 (1 мМ) и (NH4)2SO4 (20 мМ). В качестве источников углерода использовали цитрат (36 мМ) и глюкозу (16 мМ). Для поддержания культур P. chlororaphis и E. coli и при получении rpoS-мутанта использовали среду LB, жидкую и агаризованную (1.5% агара) [15]. Концентрации антибиотиков (Россия): канамицин (Km) - 100 мкг/мл, ампициллин (Ар) - 200 мкг/мл, тетрациклин (Тс) - 20 мкг/мл.
Активность GS, GDH и GOGAT измеряли в бесклеточных экстрактах из замороженных биомасс, полученных, как описано ранее [16], но клетки P. chlororaphis озвучивали (дезинтегратор MSE) 4 раза по 10 с с 10-секундным интервалом при 2°С, после чего осветляли центрифугированием 3 мин при 13000 об/мин. Активность GDH и GOGAT определяли по поглощению NADP при
340 нм и выражали в наномолях NADP/мин/мг белка [17]. Активность GS определяли по количеству глутамилгидроксамата, о котором судили по окраске с хлорным железом (540 нм) по методу [18] и выражали в микромолях гидроксамата в мин на мг белка.
Активность гистидазы измеряли по скорости образования уроконата из гистидина, которую определяли спектрофотометрически по повышению поглощения при 277 нм при рН 9.2 по методу [19] и выражали в микромолях уроконата в мин на мг белка.
Активность уреазы определяли по индикаторному методу [20].
Белок определяли по [21].
Получение мутанта P. chlororaphis 449 с нокаутированным геном rpoS . Не располагая данными о полной нуклеотидной последовательности гена rpoS P. chlororaphis 449, мы подобрали в базе данных праймеры по гену rpoS близкородственного штамма P. chlororaphis 06 [3] и с помощью ПЦР синтезировали фрагмент гена длиной 510 пн на матрице хромосомной ДНК P. chlororaphis 449. Состав праймеров и режим амплификации: прай-мер F: 5'-gcc acc tgg tgg atc gct caa acc; праймер R: 5'-cag ttc ttc tcg agg atc tca cgc, 95°С - 3 мин (95°С -40 с; 61°С - 40 с; 72°С - 50 с) х30; 72°С - 4 мин.
Полученный фрагмент клонировали в вектор pBlueskript II SK по сайтам BamHI-XhoI и секвени-ровали. Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента была высокогомологична (98-84%) последовательностям генов rpoS других псевдомонад (AY336077.1; AY586457.1; CP000094.1; AE004782.1). В полученную конструкцию вставили ген Kmr (по сайту PstI) из кассеты плазмиды pUC4K [22]. Для введения нокаутированного гена в хромосому P. chlororaphis 449 фрагмент с нарушенной последовательностью гена rpoS переклонировали по сайтам BamHI-Acc65I в конъюгатив-ную плазмиду pEX18Tc [23]. Рекомбинантную плазмиду передали трансформацией в клетки штамма E. coli S17-1, который далее служил донором при конъюгативном переносе нокаутированного гена в реципиентные клетки P. chlororaphis 449 с селекцией на среде с Km и Ap.
Отобранные клоны подвергали дополнительной очистке от меродиплоидов путем высева на среду с LB, сахарозой (5%) и Тс [23]. Из клонов, растущих на среде с Km и сахарозой, но не растущих на среде, содержащей Tc, выделяли ДНК и исследовали на наличие поврежденного гена rpoS с помощью рестрикционного анализа, а также ПЦР-анализа. На матрице хромосомной ДНК му-тантных клонов с указанных выше праймеров синтезировался единственный продукт, который был длиннее исходного фрагмента (510 пн) на величину Km-гена (~1200 пн).
Таблица 1. Влияние концентрации аммония на активности ферментов аминирования у P. chlororaphis 449
Источник углерода
Фермент цитрат (36 мМ) глюкоза (11 мМ)
избыток аммония недостаток избыток аммония недостаток
аммония аммония
GS 0.70 0.80 0.36 0.49
GDH 20.93 2.09 27.50 2.42
GOGAT 10.70 10.70 7.25 8.05
Примечание. Избыток аммония - 50 мМ (N^^04, недостаток - 1 мМ КМОз (в табл. 1-6 приведены данные типичных опытов).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сведения о наличии у P. chlororaphis NTR отсутствуют. Нами было показано, что в бесклеточных экстрактах P. chlororaphis 449 содержится ряд ферментов азотного обмена: GS, GOGAT и GDH (табл. 1).
Исследование ферментативных активностей в бесклеточных экстрактах, полученных из исходного и мутантного штаммов, выращенных в условиях избытка и недостатка аммония, показало, что изменения в активности ферментов ассимиляции аммония характерны для NTR.
Как видно из табл. 1, GDH гораздо активнее в случае избытка аммония, чем при его недост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.