БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 463-471
УДК 612.017.1.014.1.08
О ВЫЖИВАНИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ АЛКАЛОЗА И ДЕФИЦИТА АУТОКРИННЫХ ФАКТОРОВ
© 2008 г. Г. В. Луценко, М. В. Гречихина, Л. Г. Дьячкова, Н. И. Луцан
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10; факс: (495)330-40-11; электронная почта: gvlut@mx.ibch.ru Поступила в редакцию 06.05.2008 г.
Все больше данных свидетельствует о том, что выживание клеток млекопитающих находится под контролем факторов роста и аутокринных факторов выживания (АФ). Ранее мы предложили экспериментальную модель, позволяющую создавать дефицит АФ в культуре клеток и изучать последствия такого дефицита для выживания и метаболизма культивируемых клеток. В представленной работе исследовали влияние дефицита АФ на выживание, внутриклеточное содержание ATP, продукцию лактата и трансмембранный потенциал митохондрий клеток интерлейкин 2-зависимой линии CTLL-2 в условиях алкалоза (pH 8.3). Показано, что в отсутствие дефицита АФ в культуре алкалоз не влияет на выживание клеток CTLL-2. Главным способом защиты этих клеток от цитотоксиче-ского действия алкалоза является интенсификация анаэробного гликолиза, сопровождающаяся увеличением продукции лактата. В условиях дефицита АФ алкалоз приводил к значительному снижению гликолиза в культуре клеток CTLL-2, вследствие чего в них резко снижалась продукция лактата и трансмембранный потенциал митохондрий. Эти нарушения энергетического метаболизма вызывали истощение внутриклеточного содержания ATP, что приводило к гибели клеток CTLL-2 преимущественно по пути некроза.
Алкалоз - нарушение кислотно-щелочного равновесия, при котором происходит увеличение количества оснований и понижение концентрации водородных ионов, - может возникать в организме по различным причинам. Респираторный алкалоз встречается при гипервентиляции, когда выведение С02 превышает скорость его образования. При гипервентиляции понижается парциальное давление углекислого газа в альвеолярном воздухе и крови [1]. Другой тип алкалоза, метаболический, развивается при абсолютном или относительном увеличении содержания щелочных соединений в организме [2]. Хорошо известно, что щелочные условия токсичны для клеток, однако механизмы, приводящие к гибели клеток в этих условиях, изучены еще недостаточно. При щелочных значениях рН среды происходит отток протонов от внутренней мембраны митохондрий, поэтому главное повреждающее действие алкалоза на клетки связано с их энергетическим метаболизмом. На это указывают данные, полученные при культивировании клеток мышиной фибросаркомы в условиях алкалоза [3]. Показано, что при щелочных значениях рН в митохондриях происходит компенсация потерянных протонов за счет интенсификации клеточ-
Сокращения: АФ - аутокринные факторы; ДС-клетки - де-сенситизированные клетки; ИЛ - интерлейкин; МТП -митохондриальный трансмембранный потенциал; МТТ -3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид; ПИ - пропидия йодид.
ного дыхания, сопровождающегося усилением продукции супероксид-радикала, главного повреждающего фактора клеток фибросаркомы при алкалозе.
Выживание клеток в многоклеточном организме находится под контролем множества цитокинов различной природы. Такой контроль необходим для поддержания гомеостаза тканей, который достигается за счет баланса между скоростями пролиферации и гибели клеток. Ранее мы установили, что важную роль в механизме контроля выживания Т-лимфоцитов играют так называемые аутокринные факторы (АФ) выживания [4, 5]. Эти факторы, не являясь факторами роста, действуют на клетки, которые их секретируют, и таким образом участвуют в поддержании клеточного выживания [6-8].
Нами разработана экспериментальная модель, позволяющая создавать дефицит АФ в культуре клеток и изучать его последствия для выживания и метаболизма культивируемых клеток [9]. Эта модель, использованная для оценки влияния АФ на выживание клеток цитотоксической интерлейкин 2 (ИЛ-2)-зависимой линии СТЬЬ-2, включала предварительное культивирование клеток СТЬЬ-2 в условиях высокой плотности, их перенос в культуры низкой плотности и последующее культивирование в таких условиях. Основой такой экспериментальной модели послужило явление, называемое клеточной десенситизацией, или адаптацией,
заключающееся в том, что при длительном воздействии какого-либо фактора на клетки их первоначальная чувствительность к этому фактору постепенно снижается [10]. В культуре высокой плотности (в условиях повышенной концентрации АФ) клеток CTLL-2, по-видимому, происходит снижение их чувствительности к АФ. Перенос таких клеток вместе со свежей средой в культуру низкой плотности, где АФ практически отсутствуют, приводит к тому, что они начинают испытывать острую нехватку АФ (при избытке ИЛ-2 в среде). Установлено, что дефицит АФ приводит к временному нарушению гликолиза в клетках, которое проявлялось многократным снижением содержания ATP в клетках CTLL-2 в течение 1-2 мин (до 10-20% от исходного уровня), а затем постепенным восстановлением до нормального уровня в течение 2-4 ч [5].
Недавно с использованием этой модели мы исследовали влияние дефицита АФ в культуре на состояние клеток CTLL-2 при окислительном стрессе. Было показано, что в условиях окислительного стресса дефицит АФ в культуре вызывает снижение уровня внутриклеточного ATP до крайне низких значений. Это приводит к отягощению клеточного стресса, что проявляется в усилении блеббинга клеточной поверхности, падении трансмембранного потенциала митохондрий (МТП) и ускорении гибели клеток CTLL-2 по пути апоптоза или некроза [11].
В настоящее время совершенно неизученным остается вопрос о том, насколько условия алкалоза опасны для жизнеспособности и функциональной активности Т-лимфоцитов и какие факторы могут быть отягощающими в этих условиях. В представленной работе с использованием клеток ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2, адекватной модели активированных цитотоксических Т-лимфоци-тов, мы исследовали, как условия алкалоза (pH 8.3) влияют на выживание клеток Т-ряда и какую роль может играть в этих условиях дефицит АФ. Показано, что в отсутствие дефицита АФ алкалоз не влияет на выживание клеток CTLL-2. Главным способом защиты этих клеток от цитотоксическо-го действия алкалоза является интенсификация гликолиза. При дефиците АФ алкалоз приводил к падению МТП и значительному снижению гликолиза в клетках CTLL-2, вследствие чего резко снижалась продукция лактата. Эти нарушения энергетического метаболизма приводили к истощению внутриклеточного пула ATP и, как следствие, к гибели клеток CTLL-2 по пути апоптоза и некроза с преобладанием последнего.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клетки. Клетки ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2 выращивали в среде RPMI-1640 ("Sigma", США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыво-
ротки, 2 мМ L-глутамина ("Sigma"), 50 мкМ 2-мер-каптоэтанола ("Serva", Германия), 50 мкг/мл ген-тамицина и 50-100 ед/мл рекомбинантного ИЛ-2 ("Биотех", Санкт-Петербург). Клетки культивировали в 1 мл среды в 24-луночных планшетах ("Costar", США) при 37°C в атмосфере с 5% CO2. При проведении экспериментов использовали культуральную среду (pH 7.3 или 8.3) с добавлением 20 мМ HEPES ("Sigma"), 5% сыворотки и 100 ед/мл рекомбинантного ИЛ-2. В условиях алкалоза (pH 8.3) клетки культивировали при 37°C в отсутствие CO2.
Формирование дефицита АФ в культурах. Де-
сенситизированные клетки (ДС-клетки) CTLL-2 со сниженной чувствительностью к АФ получали посредством их культивирования в условиях высокой плотности в течение 18-20 ч в лунках 24-луночно-го планшета в среде с добавлением 5% сыворотки, 20 мМ HEPES и 200 ед/мл рекомбинантного ИЛ-2. Начальная плотность клеточных культур высокой плотности составляла 2 х 106 клеток/мл. Состояние дефицита АФ в культурах получали путем переноса клеток из культур высокой плотности в культуры низкой плотности. С этой целью клетки собирали, отмывали и переносили в 100 мкл свежей среды в лунки плоскодонного 96-луночного планшета ("Nunc") или в объеме 1 мл в лунки 24-лу-ночного планшета и культивировали при плотности 2 х 105 клеток/мл в среде с pH 7.3 или 8.3.
Определение выживания клеток. Выживание клеток определяли с использованием MTT-теста [12] с некоторыми изменениями. Клетки осаждали в планшете центрифугированием (400 g, 5 мин) и стряхивали надосадочную жидкость из лунок. После этого в лунки вносили по 30 мкл раствора MTT ("Sigma"), приготовленного на среде RPMl-1640 (0.5 мг/мл), и инкубировали в течение 2 ч при 37°С в атмосфере с 5% CO2. По истечении этого времени к содержимому каждой лунки добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида и растворяли кристаллы фор-мазана, образованного в результате восстановления MTT живыми клетками. Оптическую плотность содержимого каждой лунки измеряли на приборе "Multiscan MCC/340" ("Titertek", Великобритания) при длине волны 540 нм. Выживание клеток оценивали по величине оптической плотности раствора формазана в каждой пробе.
Определение содержания ATP в клетках. Содержание ATP в клетках определяли люциферин-люциферазным методом с использованием стандартного набора для определения ATP ("Sigma") на биолюминометре "Triathler" ("Hidex", Финляндия).
Определение трансмембранного потенциала митохондрий. МТП определяли с использованием метода проточной цитофлуориметрии [13]. Перед измерением клетки инкубировали при 37°C в течение 20 мин в среде RPMI-1640 с добавлением флуоресцентного зонда родамина 123 ("Molecular Probes", США) в концентрации 1 мкг/мл, после че-
го дважды отмывали холодной средой. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре "FACScan" ("Becton Dickinson", США). В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток.
Определение концентрации лактата. Концентрацию лактата в надосадочной жидкости культур определяли с использованием стандартного набора для тестирования лактата в плазме крови ("Sigma") по поглощению света при длине волны 540 нм с помощью многоканального спектрофотометра "Multiscan MCC/340". Для оценки продукции лактата исследуемыми клетками использовали бе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.