БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 5, с. 343-351
УДК 577.352.4
ОБЛЕГЧЕННОЕ ПРОНИКНОВЕНИЕ МЕТИЛВИОЛОГЕНА В ХЛОРОПЛАСТЫ in situ ПРИ ГЕНЕРАЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ИМПУЛЬСА НА ВОЗБУДИМОЙ МЕМБРАНЕ
РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
© 2008 г. А. А. Булычев, Н. А. Крупенина
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс (495)939-1115; электронная почта: bulychev@biophys.msu.ru Поступила в редакцию 15.04.2008 г.
Генерация потенциала действия (ПД) на плазмалемме водоросли Chara corallina существенно влияет на фотопроцессы в хлоропластах. В физиологических условиях ПД обратимо подавляет фотосинтетический перенос электронов, причем этот эффект выражен в разной степени для участков, формирующих щелочные и кислые зоны в окружении клетки. Вызванные генерацией ПД изменения квантового выхода фотопереноса электронов усиливаются и становятся необратимыми в присутствии акцептора метилвиологена (MV2+). Инкубация клеток Chara в покое в среде с добавлением MV2+ не сказывалась на кинетике фотоокисления хлорофилла реакционного центра фотосистемы I (ФС1) P700, свидетельствуя о том, что в покоящейся клетке MV2+ не достигает участков взаимодействия с ФС1 из-за наличия непроницаемых мембранных барьеров. Вместе с тем генерация ПД в присутствии MV2+ необратимо модифицировала сигналы фотоокисления P700, измеряемые по разности изменений поглощения в области 810 и 870 нм (ДА810), что указывает на облегченное проникновение MV2+ в хлоропласты in situ во время или после генерации ПД. Фотоиндуцированные изменения мембранного потенциала клетки, подобно сигналам ДА810, не зависели от присутствия в среде MV2+ до приложения первого возбуждающего стимула. Однако генерация ПД в присутствии MV необратимо модифицировала электрические фотоответы клетки в связи с переключением нециклического потока электронов на восстановление MV2+. Сделан вывод, что влияние ПД на фотосинтез хлоропластов in situ является комплексным и включает изменения проницаемости для MV2+ в системе мембранных барьеров "плазмалемма-оболочка хлоропласта".
Для растений, ведущих прикрепленный образ жизни и неспособных выбирать подходящее окружение, особенно важен своевременный запуск приспособительных реакций в ответ на изменения внешней среды. Одним из элементов сигнальных систем служат потенциалы действия (ПД), которые возникают и распространяются по растению под влиянием химических, механических и температурных стимулов. Эти сигналы нарушают ход клеточных процессов, вызывая, в частности, временное подавление фотосинтеза [1] и усиление защиты от избыточного освещения [2].
Влияние электрических импульсов плазмалем-мы на функции органелл представляет интерес для понимания механизмов внутриклеточной регуляции. Удобной моделью для изучения роли возбудимых мембран в активности хлоропластов служат харовые водоросли, которые эволюционно близки к высшим растениям [3] и сочетают электрическую возбудимость со способностью к фотосинтезу на уровне отдельной клетки. Механизм генерации ПД у харовых водорослей изучен достаточно полно [4, 5]. ПД связан с быстрым поступлением Са2+ из среды в цитоплазму по потенциал-зависимым каналам [6] и высвобождением Са2+ из внут-
риклеточных депо [5], а также с Са2+-активируе-мым выходом С1- из цитоплазмы в среду и последующим выходящим потоком К+. Уровень Са2+ в цитоплазме во время ПД возрастает многократно (от 0.1 до ~10 мкМ) [6], а относительные сдвиги концентрации других ионов сравнительно невелики. Генерация ПД вызывает длительную остановку потоков Н+ через плазмалемму [1], что сдвигает рН в апопласте на величину от десятых до 2.5 единиц. Поскольку зоны выведения и поглощения Н+ в освещенных клетках пространственно разделены, остановка потоков Н+, возможно, вызывает противоположные сдвиги рН цитоплазмы в разных участках клетки.
Генерация ПД в нативной клетке понижает эффективный квантовый выход первичных реакций фотосистемы II (ФС11) в щелочных участках клетки, но оказывает слабое влияние на фотохимическую активность хлоропластов в области кислых зон [7]. Кроме того, распространение ПД повышает нефотохимические тепловые потери энергии возбужденных состояний, что проявляется в обратимом снижении максимальной флуоресценции
хлорофилла Е'т [2, 8]. Тушение Е'т обусловлено
повышением ApH тилакоидов в связи с предполагаемым поступлением избытка Ca2+ из цитоплазмы в строму освещенных хлоропластов и подавлением реакций цикла Кальвина [2]. Наиболее сильное снижение F'm после генерации импульса отмечалось в присутствии двухвалентно заряженного акцептора электронов метилвиологена (MV2+) [9]. В присутствии MV2+, в отличие от стандартных условий, снижение F'm было необратимым, т.е. развивалось лишь однократно в ответ на генерацию первого ПД. Отсутствие видимых эффектов MV2+ на функции хлоропластов в покоящейся клетке отражает существование эффективных барьеров для проникновения MV2+ из среды в хлоропласты. С другой стороны, появление характерных признаков включения MV2+ в электрон-транспортную цепь (ЭТЦ) после ПД позволяет предполагать, что генерация электрического импульса облегчает поступление MV2+ в строму хлоропласта, делая его доступным акцептором.
Представляется вероятным, что влияние ПД на функции хлоропластов имеет сложную природу и может включать изменения ионной проницаемости системы "плазмалемма-оболочка хлоропласта". На модельных мембранных системах показана зависимость проводимости для MV2+ от pH среды и мембранного потенциала (МП) [10, 11]. Однако в литературе отсутствуют сведения об изменениях проницаемости биологических мембран для MV2+ под действием такого физиологического фактора, как импульсная деполяризация клетки. Вопрос о влиянии ПД на проникновение веществ в органеллы важен не только для понимания внутриклеточных взаимодействий, но имеет и практический аспект, так как MV2+ является известным гербицидом (паракват), действующим на фотосистему I (ФС1) хлоропластов.
Целью данной работы была проверка гипотезы, согласно которой MV2+ не проникает в хлоропласты покоящейся клетки Chara corallina в течение десятков минут инкубации, однако попадает в пластиды и включается в ЭТЦ фотосинтеза сразу же после генерации одиночного ПД на электровозбудимой мембране. О включении MV2+ в фотохимические реакции хлоропластов in vivo можно судить по флуоресценции хлорофилла, а также по индукционным изменениям редокс-состояния хлорофилла реакционного центра ФС1, P700. Известно, что MV2+ эффективно забирает электроны от ФС1, вызывая быстрое окисление P700 при действии света. Накопление окисленной формы P700 проявляется по возрастанию интенсивности полосы поглощения P700+ в ИК-области [12]. В связи с этим были исследованы фотоиндуцированные изменения поглощения P700+ в покоящейся клетке до и после добавления в среду MV2+, а также после генерации ПД в отсутствие и в присутствии этого
акцептора. Кроме того, о проникновении MV2+ в хлоропласты и переключении путей переноса электронов судили по нарушениям изменений МП клетки, связанных с формированием и диссипацией щелочных и кислых зон у поверхности клетки при переходах свет-темнота.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объекта исследования использовали изолированные клетки междоузлий C. corallina длиной около 6 см и диаметром 0.9-1 мм. Одиночные клетки помещали в искусственную прудовую воду, содержащую 0.1 мМ KCl, 1.0 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl2, и выдерживали до начала опыта не менее суток. В среду вносили NaHCO3 для доведения pH до 7.0-7.1. Для стимуляции фотосинтеза использовали также среду с добавлением 5 мМ MES-NaOH буфера (pH 6.2), в которой повышена равновесная концентрация СО2.
Флуоресценцию хлорофилла измеряли на микроучастках клетки с применением метода насыщающих импульсов, как описано ранее [2, 7, 13]. Для ослабления интенсивности света при измерениях световых кривых использовали стеклянные нейтральные светофильтры.
Измерения поглощения P700+ на отдельных клетках осложнены из-за малого содержания пигмента P700 (по сравнению с суммарным содержанием хлорофилла). Микрометоды для таких измерений в настоящее время отсутствуют, а при использовании стандартной аппаратуры одиночная клетка заполняет лишь небольшую часть сечения измерительного луча. В наших опытах для увеличения площади образца мы помещали в измерительную камеру четыре изолированных междоузлия, которые располагали на близком расстоянии параллельно друг другу. Фиксированное положение клеток в камере из оргстекла обеспечивалось узкими прорезями в перегородке, разделяющей камеру на два отсека.
Окислительно-восстановительные переходы хлорофилла реакционного центра ФС1 P700 регистрировали по разности изменений поглощения в области 810 и 870 нм (ДА810). Поглощение света в области 810 нм обусловлено окисленной формой P700 (P700+). Для измерений использовали систему регистрации PAM-101 (частота модуляции измерительного света 100 кГц) в сочетании с двухволно-вым эмиттерно-детекторным блоком ED-P700DW ("Walz", Германия). Двухволновая система измерений позволяет наблюдать изменения абсорбции P700+ при минимальном искажении сигнала за счет процессов другой природы. Для подведения измерительного и действующего света и направления проходящего через объект ИК-света на детектор использовали разветвленный оптоволоконный кабель. Клетки располагали между зеркальной под-
ложкой и торцом световода. Измерительный луч проходил через образец в прямом и отраженном направлении, что увеличивает длину оптического пути и способствует возрастанию амплитуды
Объект освещали белым светом осветителя KL-1500 ("Schott", Германия), а также длинноволновым красным светом (ДКС), получаемым от осветителя ОИ-28 (галогенная лампа, 70 Вт) при прохождении луча через интерференционный фильтр с максимумом пропускания в области 717 нм. ДКС поглощается только ФС1 и вызывает полное окисление P700. Плотность потока квантов фото-синтетически активной радиации (ФАР) составляла 150 мкЕ м-2 с1, время i1/2 для фронта нарастания импульса белого света - 20 мс. Длительность световых импульсов, создаваемых осветителем KL-1500, контролировали с помощью блока управле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.