МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 326-334
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.5.017.73(6-285.2)
ОБЛИГАТНО АЛКАЛОФИЛЬНЫЙ ДЕНИТРИФИКАТОР НЛЬОМОМЛЗ СЛМРКЛЫЗ ИЗ ОЗЕРА МАГАДИ, СПОСОБНЫЙ К ВОССТАНОВЛЕНИЮ ЗАКИСИ АЗОТА И ЛИШЕННЫЙ МОЛИБДЕНОВОГО КОФАКТОРА В СОСТАВЕ НИТРАТРЕДУКТАЗЫ
© 2004 г. Ю. В. Болтянская*, А. Н. Антипов**, Т. В. Колганова*, А. М. Лысенко*, Н. А. Кострикина*, Т. Н. Жилина*
*Институт микробиологии РАН, Москва **Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва Поступила в редакцию 17.11.03 г.
Из озера Магади (Кения) выделено восемь штаммов денитрифицирующих бактерий, способных к восстановлению нитрата и закиси азота при рН 10. Штаммы при некоторых различиях оказались близки по составу Г+Ц (66.1-68.1 мол. %) и ДНК-ДНК-гомологии (75-92%) и являются морфотипа-ми одного вида. Выбранный для изучения штамм 7-7398-2 на основании частичного сиквенса 16Б рРНК оказался наиболее близок с На1отопаз еатр1заШ, выделенным из озера Алкали (США). Уровень ДНК-ДНК-гомологии с типовым штаммом Н. campisalis 4А составил 88%. Штаммы близки и фенотипически, однако особенностями выделенной нами культуры является облигатная алкалофи-лия, выражающаяся в зависимости от карбонатов и невозможности роста при рН ниже 7, способность к восстановлению закиси азота и необычная нитратредуктаза, не содержащая в своем составе молибден и молибденовый кофактор.
Ключевые слова: содовые озера, алкалофилия, денитрификация, закись азота, нитратредуктаза.
Денитрификация осуществляется рядом разнообразных по таксономическому положению факультативно анаэробных микроорганизмов [1] и наряду с нитратным дыханием часто рассматривается как приспособление аэробных бактерий к анаэробным условиям. В настоящее время денитрификация описана для организмов многих физиологических групп [1-3], однако первые алкало-фильные денитрификаторы были выделены относительно недавно [4-8], и протекание процесса в условиях экстремально высокого рН до сих пор остается малоизученным.
Исследования микробных сообществ содовых озер выявили высокое содержание нитрата, связанное в первую очередь с деятельностью многочисленных азотфиксирующих цианобактерий, а также с совместным действием нитрификаторов первой [9] и второй [10] фазы. Для того чтобы цикл азота оказался замкнутым, в системе необходимо присутствие микроорганизмов, осуществляющих восстановление нитрата. Допускалось, что эта фаза может осуществляться гидрогено-трофными денитрификаторами типа Рагасоссш, однако это предположение не было подкреплено выделением чистых культур, способных осуществлять данную реакцию [11]. Исследования последних лет показали, что восстановление нитрата в содовых озерах способны осуществлять серо-окисляющие бактерии ТЫоа1ка1тЬгю ¿втМАсат
[8] и представители рода Halomonas, например Н. magadiensis [7]. В продолжение работ по изучению функционального и филогенетического разнообразия бактерий в составе алкалофильных микробных сообществ [12] в 1998 году из содового озера Магади (Кения) Т.Н. Жилиной было выделено восемь штаммов чистых культур денитри-фикаторов, показавших способность к восстановлению нитратов при рН 10.
Группой проф. Н.П. Львова (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) было обнаружено, что в составе нитратредуктаз этих штаммов отсутствуют молибден и молибденовый кофактор, что предполагает наличие необычного фермента [13]. Необычная нитратредуктаза алкалофильных де-нитрификаторов заставила предварить детальное энзимологическое исследование идентификацией и характеристикой этих организмов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и их источники. Исходным материалом для выделения штаммов служили пробы донного осадка с отмершими пурпурными бактериями на его поверхности, отобранные Г.А. Заварзи-ным в сентябре 1998 года из лагуны к северу от насыпи через озеро Магади с глубины 30 см. Вода в лагуне имела температуру 38°С, минерализацию 260 г/л, рН 10.5. Типовой штамм На1отопаз
campisalis 4A был любезно предоставлен Dr. B.M. Peyton (Washington State University, USA).
Среды и условия культивирования. Накопительные культуры были получены в строго анаэробных условиях на минеральной среде следующего состава (г/л): Na2CO3 - 90, NaHCO3 - 10, NaCl - 50, KH2PO4 - 0.2, MgCl2 ■ 6H2O - 0.05, Na2S ■ 9H2O - 0.2, дрожжевой экстракт - 0.1, раствор микроэлементов [14] - 1 мл; pH 10.2. В качестве источника энергии использовали трехводный ацетат натрия (2 г/л), в качестве акцептора электронов - нитрат натрия (1 г/л) или закись азота (под давлением 0.5 атм; объем газовой фазы составлял 60% объема сосуда для культивирования). Среду освобождали от кислорода вакуумированием с последующей продувкой аргоном.
Для выявления спектра анаэробно используемых субстратов их вносили в концентрации 2 г/л в присутствии 0.1 г/л дрожжевого экстракта и 1 г/л нитрата натрия. Для проверки роста в аэробных условиях нитрат натрия заменяли хлоридом аммония (0.5 г/л), чтобы исключить возможность восстановления нитрата после исчерпания доступного кислорода. Сахара в виде концентрированных водных растворов вносили в стерильную щелочную среду непосредственно перед засевом во избежание их карамелизации.
После оптимизации среды соотношение натриевых солей было (г/л): Na2CO3 - 30; NaHCO3 -50; NaCl - 0; pH 9.25. Сульфид натрия не вносили, поскольку культура оказалась высокочувствительной к нему. Остальные компоненты исходной среды оставляли без изменений.
Акцепторы вносили в виде концентрированных растворов до следующих концентраций (мМ): NaNO3 - 10, NaNO2 - 2, фумарат - 10, Na2SO4 - 10, Na2SO3 - 2 и 10, Na2S2O3 - 10, S0 - 2% (вес/объем), N2O - под давлением (0.5 атм). Использование серосодержащих акцепторов определяли по образованию сульфида, азотсодержащих - по появлению газообразного азота.
Для получения pH зависимости нужные значения рН устанавливали подтитровкой среды 6 M HCl и 12 M NaOH, при этом карбонат натрия заменяли бикарбонатом и уменьшали его концентрацию в 10 раз, а оптимальную молярность по натрию поддерживали добавлением хлорида натрия. Зависимость от карбонатов изучали при замене их эквимолярным по натрию количеством NaCl. В этом случае для поддержания рН применяли 50 мМ сериновый буфер (pH 9). Потребность в хлориде выявляли заменой NaCl эквимолярным по натрию количеством карбоната и бикарбоната в соотношении, поддерживающем оптимальное значение рН. При этом хлорид магния и хлориды в микроэлементах заменяли сульфатами. Для выявления потребности в ионе Na+ все натриевые соли заменяли на калиевые.
Для определения зависимости роста от концентрации NaCl общее содержание карбонатов в среде снижали в 10 раз, а NaCl в количестве от 0 до 30% (вес/объем) вносили отдельно в каждую пробирку. Температурную зависимость снимали при оптимальных значениях pH и минерализации. Термоустойчивость выявляли путем инкубации культуры, взятой со стационарной стадии роста, в течение 10 и 50 мин при 70°С с последующим высевом на жидкие питательные среды оптимального состава.
Аналитические определения. Рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при 600 нм на спектрофотометре Spekol (Jena) непосредственно в пробирках Хангейта или в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Количество ацетата измеряли на хроматографе модели 3700 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Азот, кислород и водород количественно определяли на газовом хроматографе ЛХМ-80 с катаро-метром. Разделение проводили на колонке, заполненной молекулярным ситом 5 А, при комнатной температуре. Количество закиси азота измеряли на хроматографе модели 3700 с катаро-метром, на колонке, заполненной Chromosorb 101 (температура колонки 50°С). Нитрит определяли спектрофотометрически при 548 нм по образованию окрашенного азокомплекса с сульфанило-вой кислотой и 1-^нафтилэтилендиамином, сульфид - по специфичной реакции образования метиленовой сини [15]. Содержание тиосульфата в среде контролировали методом йодометричес-кого титрования. Общий клеточный белок определяли по Лоури. Тесты на наличие каталазы и оксидазы проводили по стандартным методикам соответственно с 3% H2O2 и ^^^'^'-тетраме-тил-и-фенилендиамином ■ 2HC1. Наличие молибденового кофактора определяли с использованием мутанта nit-1 гриба Neurospora crassa, содержащего дефектную по молибдокофактору нитратредукта-зу. При комплементации молибдокофактора с апонитратредуктазой мутанта nit-1 происходит сборка функционально активного фермента [16].
Анализ ДНК. Выделение и очистку ДНК проводили, как описано ранее [17]. Содержание Г+Ц пар определяли по кривым термической денатурации, используя спектрофотометр Pye Unicum SP 1800, и рассчитывали по формуле: Г+Ц, мол. % = = Гпл - 106.4. Уровень гомологии ДНК определяли по методике [18].
Определение и анализ последовательности гена 16S рРНК проводили, как описано ранее [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение чистых культур. Накопительные культуры денитрифицирующих бактерий были получены на высокоминерализованной щелоч-
5 ч А""
/ V /
* - / ^ N
" / / 1 г У л
N - * \ 1
1 /
10 мкм 1 1 > 1 г 1 ^
Рис. 1. Клетки в световом микроскопе в экспоненциальной фазе роста. Фазовый контраст. Масштаб соответствует 10 мкм.
ной среде с ацетатом и нитратом при рН 10.2 и 37°С. На 6-е сут роста в качестве доминирующей микрофлоры присутствовали крупные (до 1 мкм) подвижные кокки - одиночные, в парах или в гроздевидных скоплениях, где они были погружены в слизь, а также подвижные палочки того же диаметра - одиночные, в парах или коротких цепочках. В качестве сопутствующей микрофлоры обнаружены подвижные спириллы и неподвижные тонкие короткие палочки. Чистые культуры были выделены в строго анаэробных условиях путем десятикратных разведений с последующим высевом на агаризованную среду с 3% агара, содержание карбонатов в которой было снижено в 10 раз, а необходимая молярность по натрию поддерживалась КаС1. Выделенные штаммы несколько различались формой, цветом и размером колоний, морфологией клеток и степенью адгезии. При аэробном росте в жидкой среде часть из них образовывала пленку на поверхности. При анаэробном росте у большинства штаммов было обнаружено образован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.