БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 474-478
УДК 577.3+578.61
ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКА СЕМЕЙСТВА KIR6 В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА И ПЕЧЕНИ КРЫС МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОННОЙ
МИКРОСКОПИИ
© 2013 г. Е. Ю. Таланов1, Л. Л. Павлик1, 2, М. И. Шигаева1, Н. В. Белослудцева1, 2,
Д. А. Мошков1, 2, Г. Д. Миронова1, 2*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино Институтская ул., 3; *электронная почта: mironova40@mail.ru 2Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3 Поступила в редакцию 30.04.2013 г.
Проведено электронно-микроскопическое исследование срезов ткани печени и сердца крыс с использованием первичных коммерческих антител к КШ6.2 и вторичных антител, коньюгированных с коллоидным золотом. Обнаружено, что меченный гранулами золота белок локализован в митохондриях кардиомиоцитов и гепатоцитов, но отсутствует в шероховатом и гладком эндоплазмати-ческом ретикулуме клеток печени, а также в миофибриллах миокарда. В митохондриях сердца и печени гранулы золота располагались преимущественно в кристах, и не были выявлены в митохон-дриальном матриксе и межмембранном пространстве. Эти данные свидетельствуют о том, что митохондрии сердца и печени содержат белок, близкий по структуре к каналообразующей субъединице цитоплазматического калиевого канала, КШ6.2. На это указывает также наличие общих модуляторов АТР-зависимых калиевых каналов, цитоплазматических и митоходриальных. Обсуждается возможная роль изучаемого белка в качестве канальной субъединицы АТР-зависимого калиевого канала митохондрий.
Ключевые слова: митохондрии, митохондриальный АТР-зависимый калиевый канал, глибенкла-мид, цитоплазматический АТР-зависимый калиевый канал, КШ6.2.
Б01: 10.7868/80233475513050186
В последнее время АТР-зависимым калиевым каналам уделяется большое внимание, так как они играют существенную роль в защите сердца от ишемии [1, 2]. Эти каналы как в клеточных мембранах, так и в митохондриях обнаружены относительно недавно [3—5], хотя впервые белок-канал с подобными свойствами был выделен нами из митохондрий значительно раньше [6]. Структура цитоплазматического канала (ци-тоКАТР), у которого имеется специфический ингибитор — глибенкламид, к настоящему времени уже установлена [5]. Показано, что цитоКАТР состоит из двух субъединиц, канальной и регуля-торной. Канальная субъединица принадлежит к семейству каналов К1Я6, имеющих "выпрямляющие" характеристики. Данные о структуре мито-хондриального АТР-зависимого калиевого канала (митоКАТР) противоречивы. Одни авторы полагают, что этот белок подобно цитоКАТР содержит К1Я-субъединицу [7, 8]. Другие считают, что структура митохондриального белка-ка-
нала отличается от KIR [9]. Однако прямые доказательства этих предположений до сих пор не получены.
В нашей лаборатории развивается представление о том, что в митохондриях представлены два различных по структуре митоКАТР-канала [10]. Ранее из митохондрий печени крысы нами был выделен электрофоретически чистый белок-канал с молекулярной массой 57 кДа, который при встраивании в бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировал ATP-зависимые К+-селек-тивные каналы, не ингибируемые глибенклами-дом [11, 12]. Антитела к этому белку ингибировали на 40—50% АТР-зависимый транспорт калия в митохондриях. С помощью MS-MALDI-TOF/TOF-анализа обнаружено, что структура этого белка отличается от структуры канальной субъединицы цитоКАТР-канала. Кроме того, локализация исследуемого белка в митохондриях подтверждена методом иммуноэлектронной микроскопии [10, 13].
Рис. 1. Иммуноэлектронные микрофотографии кардиомиоцита (а) и гепатоцита (б) в контроле (первичные антитела заменены ПБС-буфером) и после обработки антителами против К1К6.2 (в — кардиомиоцит, г — гепатоцит). Масштабный отрезок 0.25 мкм.
В настоящей работе мы продолжили изучение структуры митоКАХР-канала и предприняли попытку методом электронной микроскопии выяснить, присутствует ли в митохондриях белок, взаимодействующий со специфическими антителами к цитоплазматическому белку KIR6.2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Иммуноэлектронная микроскопия. В работе использовали коммерческие антитела к KIR6.2 (Santa Cruz Biotechnology, США). Ткань печени и сердца половозрелых белых крыс весом 220—250 г фиксировали в течение 4 ч в растворе, содержащем 4% параформальдегид и 0.5% глутаровый альдегид на 0.1 М какодилатном буфере (pH 7.4), при комнатной температуре. После этого ткани дополнительно фиксировали в течение 1 ч в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали этанолом в возрастающих концентрациях и заливали в эпон-812. Для послезали-
вочной иммунозолотой электронной микроскопии использовали разработанную нами методику [14], модифицированную для целей исследования. Готовили ультратонкие срезы полученных блоков (толщиной 80 нм) на ультрамикротоме EM UC6 (Leica, Германия) и помещали на палла-дированные сеточки без подложки. Образцы обрабатывали во влажной атмосфере в чашке Петри в каплях соответствующих растворов, приготовленных на PBS-буфере и нанесенных на пленку из парафильма. Сначала сеточки со срезами протравливали 2% раствором натрийпериодата и 1% раствором перйодной кислоты. Затем инкубировали в течение 30 мин в растворе суперблока (Superblock-TBS, Pierse, США), 30 мин в 5% феталь-ной сыворотке, а затем, не отмывая, оставляли инкубироваться на ночь при 4°С со специфическими кроличьими антителами к KIR6.2, взятыми в разведении 1 : 30. Во всех процедурах использовали ПБС-буфер, содержащий 0.01% тритон Х-100. После инкубации с антителами,
476
ТАЛАНОВ и др.
Рис. 2. Иммуноэлектронные микрофотографии участков кардиомиоцита (а) и гепатоцита (б) после обработки антителами против К1Я6.2 . Масштабный отрезок 0.25 мкм.
образцы тщательно отмывали ПБС-буфером (рН 7.4), содержащим 0.01% тритон Х-100 и 0.1% глицин, и помещали на каплю вторичных антикроличьих антител, меченных коллоидным золотом с размером гранул 10 нм, в разведении 1 : 20 (anti-rabbit IgG, Sigma-Aldrich, США), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки образцы окрашивали уранилаце-татом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Tesla BS-500 (Чехословакия). Специфичность метода проверяли, заменяя первичные антитела на использованный буфер.
Измерение Sr2+-индуцированного выхода ионов калия из митохондрий печени крысы с использованием ион-селективного электрода. Изменение [K+] в среде инкубации после добавки SrCl2 (200 нмоль/мг белка) к суспензии митохондрий печени крысы измеряли с помощью К+-селектив-ного электрода (Нико Аналит, Россия) на электрометрической системе Record 4 (Россия) в кювете объемом 1 мл при постоянном перемешивании
и термостатировании (25°С). Среда инкубации содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 1 мМ №Н2Р04, 5 мМ янтарную кислоту, 1 мМ ротенон, 1 мкг/мл олигомицина, 10 мкМ EGTA, 10 мМ НЕРЕ8-№0Н (рН 7.3). Концентрация митохон-дриального белка в кювете составляла 1 мг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Иммуноэлектронные микрофотографии срезов ткани сердца крысы в контрольных образцах, где специфические первичные антитела были заменены буфером (рис. 1а), показали, что золотая метка отсутствует в митохондриях, лежащих вдоль миофибрилл кардиомиоцитов, и в окружающей ткани. В контроле золотая метка отсутствовала также в клетках печени и окружающей их ткани (рис. 1б).
После инкубации срезов ткани с первичными антителами против К1Я6.2 и вторичными антикроличьими козьими антителами, конъюгирован-ными с золотой меткой, специфическое интенсивное мечение митохондрий можно видеть как в кар-диомиоцитах, так и в гепатоцитах (рис. 1в, г). Видно, что частицы коллоидного золота локализуются в митохондриях кардиомиоцитов и гепа-тоцитов, и отсутствуют на мембранах шероховатого эндоплазматичсекого ретикулума и цистернах гладкого ретикулума клеток печени (рис. 2а), а также на миофибриллах миокарда (рис. 2б). В митохондриях эти гранулы расположены в области крист, и их нет в межмембранном пространстве. Эти наблюдения указывают на то, что антитела против К1Я6.2 специфически связаны с белком, локализованным в митохондриях как кардиомиоцитов, так и гепатоцитов. Стоит отметить также, что исследуемый белок присутствовал на цитоплазматических мембранах клеток сердца и печени (данные не приведены).
Полученные нами данные позволяют заключить, что белок, подобный канальной субъединице цитоКАТР-канала — К1Я6.2, присутствует в митохондриях сердца и печени крысы. Следует подчеркнуть, что этот белок локализуется во внутренней мембране митохондрий и отсутствует как в миофибриллах, так и в эндоплазматическом ретикулуме.
На присутствие в митохондриях белка семейства К1Я6 может указывать также наличие общих модуляторов цитоКАТР- и митоКАТР-каналов, например, глибенкламида [15], известного ингибитора цитоплазматического канала, и ряда других соединений [16].
Ингибирующее влияние глибенкламида на митохондриальные системы транспорта К+ подтверждено нами на модели 8г2+-индуцированного транспорта К+. Принято считать, что основная
[K+], мкМ 36 32 -28 -24
20
1 мин
Рис. 3. Влияние глибенкламида на 8г2+-индуциро-ванный транспорт К+ в митохондриях печени крысы. Добавки: 200 нмоль 8гС^/мг белка. 1 — контроль; 2 — в присутствие 1 мкМ глибенкламида. Среда инкубации содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахароза, 1 мМ №Н2Р04, 5 мМ янтарная кислота, 1 мМ ротенон, 1 мкг/мл олигомицин, 10 мкМ EGTA, 10 мМ НЕРЕ8-№0Н (рН 7.3). Представлены типичные кривые (п = 5).
функция митоКАТР-канала, наряду с системой электронейтрального выхода иона, состоит в поддержании объема митохондрий [17]. Активация выхода К+ из органелл, наблюдаемая при различных метаболических состояниях организма и сопровождаемая уменьшением объема митохондрий, может компенсироваться за счет активации входа иона, опосредованного открытием ми-тоКАТР-канала. И наоборот, активация входа К+ сопровождается усилением его выхода из митохондрий [18, 19].
На рис. 3 представлено изменение [К+] в среде инкубации после добавления ионов 8г2+ к суспензии митохондрий печени крысы. Показано, что в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.