ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 4, с. 307-313
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 591
ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНОВ, АКТИВНЫХ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ, ПОСРЕДСТВОМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТРЭППИНГА
© 2004 г. Л. М. Федоров
Медико-генетический научный центр РАМН 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1 Институт биологических наук (Биоцентр) им. Теодора Бовери Баварского университета им. Юлиуса
Максимилианса, Вюрцбург, Германия Поступила в редакцию 17.03.03 г.
Окончательный вариант получен 11.03.04 г.
Генетический трэппинг (trapping - охота с помощью ловушек) является одной из наиболее перспективных технологий векторного мутагенеза, используемых для выявления генов, активных в эмбриональном развитии. В работе представлено краткое описание технологии генного трэппинга, основанного на применении эмбриональных стволовых клеток и векторов, содержащих репортерный ген lacZ без промотора, а также и результаты, полученные с использованием этой технологии. Всего было получено четыре трансгенные линии мышей, у трех из которых вектор интегрировал в гены, активные в период эмбриогенеза. В результате наблюдали различные паттерны экспрессии в-галактозидазы в зачатках конечностей, сердце, печени и других органах на разных стадиях эбрионального развития. В настоящее время ведется детальное изучение места и времени действия мутированных генов в эмбриональном и постнатальном развитии, а также молекулярно-генетическая идентификация этих генов.
Ключевые слова: генетический трэппинг, генетическая ловушка, мутагенез, эмбриональные стволовые клетки, паттерн экспрессии ¡аеХ.
Классические методы мутационной генетики, основанные на применении химических мутагенов или рентгеновского облучения, часто приводят к одновременным мутациям сразу нескольких генов, а также к различным хромосомным перестройкам. Это значительно усложняет процесс идентификации и определения физиологической роли отдельных генов и удлиняет время их картирования. Бурное развитие молекулярной генетики и эмбриологии в конце прошлого столетия позволило создать принципиально новые технологии мутагенеза. В основе этих технологий лежат эмбриональные стволовые (ЭС) клеточные линии и генетические векторы, используемые в качестве мутагенов. Мышиные ЭС-клеточные линии являются плюрипотентными стволовыми клетками, впервые полученными культированием внутренней клеточной массы бластоцист мышей ин-бредной линии 129/Sv (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). При определенных условиях культивирования in vitro эти клетки долгое время могут оставаться в недифференцированном состоянии.
Реинтродукции ЭС-клеток (ЭСК) обратно в эмбрион посредством инъекции в бластоцисту (Bradley et al., 1984) или агрегации с морулой (Wood et al., 1993) и последующая трансплантация химерных эмбрионов в матку ложнобеременной самки не нарушают их эмбрионального развития и приводят к
рождению нормального жизнеспособного потомства. В период эмбриогенеза ЭСК могут колонизировать все ткани химерного эмбриона, включая линию половых клеток, а после дифференцировки ЭС-клеточный компонент участвует в сперматогенезе у взрослых химер. Введение в ЭСК генетических векторов, несущих определенные трансгены, посредством электропорации или ретровирусной инфекции практически не влияет на способность трансгенных ЭСК колонизировать линию половых клеток химеры и тем самым передавать эти трансгены потомству (Fedorov et al., 1997). Следовательно, ЭСК служат как бы мостиком между генетическими манипуляциями in vitro и биологическим анализом последствий, вызванных этими манипуляциями in vivo. Как уже было упомянуто выше, другим необходимым техническим средством векторного мутагенеза являются сами векторы. Наиболее широкое распространение получила технология генного таргетинга (gene targeting), которая по существу является сайтнаправленным мутагенезом. Наличие полностью или частично клонированного гена позволяет сконструировать нокаутный вектор, содержащий фрагменты ДНК этого гена, и посредством гомологичной рекомбинации осуществить в клетке нокаут только этого, заранее выбранного, гена. В связи с тем что частота гомологичной ре-
307
5*
Инъекция в бластоцисту
Селекция клонов Р-гал.+
Трансплантация в матку ложнобеременной самки
• О СГ он
• • О j
Электропорация или
трансфекция ЭСК
Анализ линии половых клеток у химер
'ООО ООО vO О Q,
Анализ экспрессии lacZ i эмбриогенезе
Л
Секвенирование и картирование
мутированных генов
Рис. 1. Схема генетического трэппинга, используемого для выявления генов, активных в эмбриогенезе.
комбинации очень мала (10 5-10 7), таргетинг осуществляется in vitro с использованием ЭСК.
Другим вариантом векторного мутагенеза, основанном также на применении ЭСК, является генетический трэппинг (trapping - охота с помощью ловушек). Поскольку, в отличие от тарге-тинг-вектора, любой трэп-вектор не содержит фрагментов гомологии с геномной ДНК, то его интеграция происходит в случайные сайты и вызывает мутации и одновременное маркирование большого числа генов (Gossler et al., 1989). Основными элементами любого трэп-вектора являются два гена: репортерный lacZ, кодирующий Р-га-лактозидазу и дающий возможность гистохимического выявления, и ген неомицинфосфатранс-феразы, обеспечивающий резистентность клеток к генетицину (G418) в процессе селекции. Удачным конструктивным решением было создание экспрессионной кассеты Pgeo, объединяющей оба гена в одной рамке считывания (Freidrich, Soriano, 1991). Для трэппинга используются три основных вида трэп-векторов: промоторный, генный и энхансерный. Промоторный трэп-вектор не содержит промотора и других регуляторных элементов, поэтому экспрессия репортерного гена и, соответственно, селекция позитивных клонов возможны только в случае инсерции вектора в рамке считывания в экзон экспрессирующего гена (Gossler et al., 1989; Skarnes et al., 1992). Ген-
ный трэп-вектор тоже не содержит промотора, и его экспрессия зависит от эндогенного промотора. Однако генный трэп-вектор в отличие от промо-торного содержит сплайс-акцептор перед репор-терным геном, что обеспечивает его экспрессию после интеграции в интроны и увеличивает эффективность трэппинга в десятки раз (Friedrich, Soriano, 1991; Skarnes et al., 1992). Энхансерный трэп-век-тор содержит минимальный промотор, и экспрессия lacZ позволяет выявлять энхансерные элементы, усиливающие экспрессию трансгена (Korn et al., 1992). Ограничение энхансерного трэппинга связано с тем, что в некоторых случаях энхансе-ры локализованы на расстоянии 10-15 т.п.н. в обе стороны от промотора, в связи с чем клонирование и секвенирование геномных последовательностей, фланкирующих трансген, не обязательно выявляет энхансерные элементы. Подробное описание различных модификаций трэп-век-торов, используемых для мутагенеза ЭСК in vitro, приведено в обзорах (Cecconi, Meyer, 2000; Stanford et al., 2001). Наиболее интересной областью применения генного трэппинга является идентификация локусов мышиного генома, транскрип-ционно активных в период эмбрионального развития (Gossler et al., 1989). Экспрессия репортерного гена lacZ зависит от активности промотора "пойманного" гена и отражает паттерн экспрессии маркированного гена в эмриогенезе (Skarnes
й а1., 1992), а наличие голубой окраски позволяет гистохимически определить место и время действия гена, т.е. выявить все ткани и органы, а также период времени, в которых экспрессируется данный ген. Общая схема идентификации активных в эмбриогенезе генов посредством генного трэппинга приведена на рис. 1. В настоящей работе, используя технологию генного трэппинга, были получены трансгенные линии мышей и проведен первичный анализ экспрессии мутированных генов в период эмбриогенеза.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Мышиные ЭСК линии R1 (129/J х 129/Sv-CP)Fx культивировали на первичных эмбриональных фибробластах, как описано ранее (Fedorov et al., 1997). Для генного трэппинга использовали плаз-миду pSAßgeo, содержащую акцептор сплайсинга от большого позднего транскрипта аденовируса (интрон 1/экзон 2), беспромоторную репортерно-селективную кассету ßgeo, состоящую из бактериальных генов lacZ и neo, а также сигнал поли-аденилирования гормона роста быка (Friedrich, Soriano, 1991). ЭСК (пассаж 18) электропорирова-ли вектором pSAßgeo, линеаризированным рест-риктазой Asp700. Последующую селекцию резистентных клонов в присутствие генетицина (G418) проводили, как описано ранее (Fedorov et al., 1997). Клетки позитивных ЭС-клонов были инъецированы в бластоцисты гибридного бэкграунда (B6D2FX) х B6, последние были трансплантированы в матку ложнобеременных самок линии NMRI (Миталипов и др., 1993). У родившихся животных химеризм определяли по наличию окраски агути в шерстном покрове. Химерных самцов, имеющих преимущественное содержание окраски агути в шерстном покрове, скрещивали с самками линии B6 для выявления включения ЭС-компонента в линию половых клеток. ЭС-клоны, резистентные к генетицину, и потомство, полученное от химерных мышей, генотипировали посредством ПЦР с использованием праймеров, соответствующих гену lacZ: (прямой) 5'-CAG TTT ACC CGC TCT GCTAC-3' и (обратный) 5'-GCG TTG GCA ATT TAA CCG CC-3', по ранее описанной программе (Fedorov et al., 2001). Выявляемый фрагмент имел длину 450 п.н. Дополнительно интеграцию трансгена анализировали методом Саузерн-блот-гибридизации (Sambrok et al., 1989). Для этого геномную ДНК, выделенную из ЭСК и хвостов тестируемых животных фенол-хлороформным методом, обработали рестриктазой EcoRI или HindII. Для гибридизации использовали фрагмент в 800 п.н. (кодирующий ген neo), выделенный из плазмиды pSAßgeo рестриктазами BamHI и Xbal. Экспрессию ß-галактозидазы в трансгенных ЭСК и эмбрионах выявляли гистохимическим окрашиванием X-gal (Fedorov et al., 2001).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате электропорации ЭСК линии R1 и последующей селекции в среде, содержащей ге-нетицин, было отобрано 59 резистентных колоний, имеющих четкие границы и состоящих из мелких недифференцированных клеток (рис. 2, а). Все новые ЭС-клоны, полученные культивированием отобранных колоний и генотипированные посредством ПЦР, оказались трансгенными (рис. 3, а). Далее эти клоны были протест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.