ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 11, с. 1224-1229
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544.5:615.322
ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФЕНОЛЬНЫХ И КОРИЧНЫХ КИСЛОТ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТАХ © 2015 г. Н. Ю. Сипкина*, Ю. А. Скорик*, ** 1
*Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия 197022 Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14 **Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой просп. ВО, 31 1Е-таИ: yury_skorik@mail.ru Поступила в редакцию 02.03.2015 г., после доработки 06.04.2015 г.
Оптимизированы хроматографические условия и получены метрологические характеристики методики обнаружения и определения 12 фенольных и коричных кислот в экстрактах лекарственных растений методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. Хроматографирование проводили в режиме градиентного элюирования, используя в качестве подвижной фазы водный раствор трифторуксусной кислоты и ацетонитрил. Для увеличения чувствительности спектрофотометриче-ское детектирование проводили в максимумах светопоглощения индивидуальных кислот. Методика использована для обнаружения и определения фенольного комплекса в сухих экстрактах Астрагала длиннолистного и Астрагала коротколопастного.
Ключевые слова: фенольные кислоты, коричные кислоты, ВЭЖХ, растительные экстракты.
БО1: 10.7868/80044450215110158
Исследование растительных объектов с целью обнаружения и идентификации лекарственных веществ — актуальная задача современной аналитической химии и фармакогнозии. Определение фенольных соединений в растительных экстрактах является сложной задачей в связи с их разнообразием, сходством структур, а также присутствием большого количества посторонних компонентов [1, 2]. Из-за многочисленности и разнообразия форм фенольных соединений часто определяют их общее содержание в экстрактах лекарственных растений без идентификации. Существует множество методик определения общего содержания фенольных соединений в растительных экстрактах. Например, сумму флавоноидов и фенольных кислот определяют как прямым спектрофотомет-рическим методом в пересчете на рутин, кверце-тин, гиперозид и другие стандартные образцы [3], так и спектрофотометрическим методом с предварительной дериватизацией исследуемого образца [4, 5]. Распространен хроматографический метод определения суммы фенольных соединений, при котором суммируют все пики на хрома-тограмме в определенном временном интервале и рассчитывают содержание суммы фенольных соединений относительно стандартного образца [6]. В настоящее время разрабатывают методы идентификации фенольных соединений в раститель-
ном сырье с помощью спектроскопии ЯМР высокого разрешения по принципу "отпечатков пальцев" [7]. Однако для обнаружения и определения индивидуальных фенольных соединений в растительных экстрактах наиболее перспективна ВЭЖХ [8—10]. При разделении обычно применяют обращенно-фазовый вариант хроматографии в режиме градиентного элюирования [11—15]. Существующие методики определения фенольных соединений методом ВЭЖХ позволяют идентифицировать только некоторые агликоны феноль-ных и коричных кислот, а также ряд флавоноидов.
Настоящая работа посвящена разработке методики определения 12 индивидуальных фенольных и коричных кислот в растительных экстрактах методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием, увеличению селективности и эффективности разделения, а также расширению числа определяемых фенольных кислот для возможности проведения скрининговых исследований данных соединений в растительных экстрактах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и материалы. Для приготовления элю-ента использовали трифторуксусную кислоту (ТФУ) ос. ч., ацетонитрил и воду очищенную ос. ч. (для градиентной ВЭЖХ). Для растворения стан-
дартных образцов и исследуемых экстрактов использовали этанол х. ч., в качестве стандартных образцов использовали чистые вещества с содержанием основного вещества не менее 99.0%. Сухие экстракты Астрагала длиннолистного (Astragalus dolichophyllus) и Астрагала коротколопастного (Astragalus brachylobus) предоставлены кафедрой технологии лекарств Пятигорского медико-фармацевтического института. Образцы растворяли в ультразвуковой ванне Сапфир (рабочая частота 35 кГц, мощность генератора 100 Вт). Для фильтрования стандартных и испытуемых растворов использовали мембранные капроновые фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Технофильтр, Россия).
Аппаратура и хроматографические условия. Работа выполнена на жидкостном хроматографе LC-20AB фирмы Шимадзу (Япония) с диодно-матричным детектором SPD-M20A на колонке Zorbax Eclipse XDB C18 250 х 4.6 мм c размером частиц 5 мкм, объем пробы 20 мкл, скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин, температура термостата колонки 40°С. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0.03%-ного водного раствора ТФУ (элюент А) и ацетонитрила (элюент Б). Элюировали в градиентном режиме: 0—12 мин 90% элюента А, 12-28 мин 90-80% элюента А, 28-30 мин 80% элюента А, 30-40 мин 80-65% элюента А, 40-60 мин 65% элюента А.
Приготовление растворов. Навеску около 10 мг стандартного образца фенолокислоты помещали в мерную колбу емк. 10.0 мл, прибавляли 5 мл этанола, выдерживали в ультразвуковой ванне 15 мин, разбавляли до метки этанолом. Полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр. Стандартные растворы для хроматографирования готовили последовательным разбавлением исходных стандартных растворов 0.03%-ным водным раствором ТФУ.
В случае растворов сухих экстрактов навеску около 25 мг сухого экстракта помещали в мерную колбу емк. 25.00 мл, прибавляли 2.5 мл этанола, выдерживали в ультразвуковой ванне 15 мин и разбавляли до метки 0.03%-ным водным раствором ТФУ. Полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение большого числа соединений из одной хроматограммы может снижать эффективность и селективность разделения. В то же время, подбор хроматографических условий для различных классов фенольных соединений может значительно увеличить объем работы и продолжительность анализа. Достижение оптимальных хроматографических характеристик (разрешение критических пар, параметр асимметрии пика, эффективность) для большого числа раз-
деляемых компонентов за один анализ является достаточно сложной задачей. В данной работе подобраны условия хроматографического разделения ряда фенольных и коричных кислот с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. В качестве неподвижной фазы использовали модифицированный октадецилсиликагель с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза представляла собой смесь водного раствора ТФУ и ацетонитрила. Для увеличения селективности хромато-графической системы и разделения критических пар аналитов использовали режим градиентного элюирования с постепенным увеличением содержания ацетонитрила в системе.
Для подавления равновесных процессов на поверхности неподвижной фазы в качестве водного компонента подвижной фазы обычно используют буферные растворы с рН 2.5—3 [16], однако применение фосфатного буферного раствора не позволило избежать уширения хроматографических пиков, что привело к общему снижению эффективности разделения. Аналогичные результаты представлены в работе [11]. Замена фосфатного буферного раствора на 0.03%-й водный раствор ТФУ с тем же рН позволило увеличить эффективность хроматографической системы, а также нормализовать факторы асимметрии для всех пиков на хроматограмме. На форму пиков и, следовательно, на эффективность разделения влияет также состав растворителя проб. При хроматографи-ровании образцов, растворенных в органических растворителях (например, в ацетонитриле или метаноле и этаноле), происходит размывание хроматографических зон на колонке с существенной потерей эффективности элюируемых соединений и нарушением фактора асимметрии. В ходе разработки хроматографических условий установлено, что для достижения приемлемых характеристик пиков все хроматографируемые растворы должны содержать не менее 80% 0.03%-ного раствора ТФУ, т.е. растворитель проб должен быть максимально приближен к начальному составу подвижной фазы.
Начальная концентрация ацетонитрила 10% и дальнейшее элюирование в течение 12 мин в изо-кратическом режиме позволило увеличить времена удерживания галловой и протокатеховой кислот и минимизировать фактор асимметрии этих пиков. Линейное увеличение концентрации ацетонитрила в системе на 10% за 16 мин привело к селективному разделению группы соединений, состоящей из хлорогеновой, (+)-катехина, ванилиновой, кофейной и сиреневой кислот. Факторы разрешения пиков (К) на хроматограмме, полученной при 276 нм, приведены в табл. 1 и составляют более 1.5 для всех пар, что свидетельствует о разделении всех пиков, достаточном для количественного определения. Для обеспечения выхода
Таблица 1. Хроматографические характеристики пиков фенольных и коричных кислот, полученные из хромато-граммы раствора смеси стандартных образцов
Кислота Время удерживания, мин Асимметрия пика Число теор. тарелок R (276 нм)
Галловая 4.20 1.35 9132 -
Протокатеховая 7.79 1.25 14327 15.6
Хлорогеновая 15.24 1.27 13099 17.0
(+)-Катехин 17.74 1.19 17858 4.2
Ванилиновая 18.99 1.14 22222 2.1
Кофейная 20.45 1.29 13099 3.6
Сиреневая 21.90 1.17 41317 2.8
4-Гидроксикоричная 29.26 1.23 87036 16.3
Феруловая 32.90 1.23 125357 8.7
Вератровая 33.93 1.16 130171 2.5
Салициловая 39.84 1.14 169602 14.6
Розмариновая 41.11 1.22 615733 4.2
Коричная 46.42 1.17 396519 20.7
Таблица 2. Метрологические характеристики уравнений линейной регрессии, пределы обнаружения (I) и определения (II) фенольных и коричных кислот (мкг/мл)
Кислота Длина волны детектора, нм b, (мкВ с мл)/мкг I II
Галловая 276 302046 0.16 0.052
Протокатеховая 261 412162 0.20 0.067
Хлорогеновая 330 279618 0.91 0.30
Ванилиновая 260 346527 0.26 0.085
Кофейная 330 543424 0.065 0.021
Сиреневая 276 318527 0.16 0.051
4-Гидроксикоричная 310 786288 0.57 0.19
Феруловая 330 533 320 0.60 0.20
Вератровая 261 488236 0.15 0.050
Салициловая 237 353155 0.05 0.015
Розмариновая 330 313919 0.50 0.16
Кори
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.