БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 314-315
ПИСЬМА В РЕДАКЦИЮ =
УДК 577.352.332:577.112
ОБНАРУЖЕНИЕ ИУК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА НА ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЕ
© 2008 г. Н. В. Озолина, Р. К. Саляев, Л. А. Ситнева, В. Н. Иурминский
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033 Иркутск, а/я 317; факс (3952) 510-754; электронная почта: ozol@sifibr.irk.ru Поступило в редакцию 20.02.2008 г.
Фитогормоны, в частности ауксин (индолил-3-уксусная кислота, ИУК), играют важную роль в системах регуляции у растений. В последние годы доказано присутствие ряда рецепторов ИУК в плазма-лемме и в мембранах внутриклеточных компарт-ментов клетки [1, 2]. Ранее нами было показано изменение активности протонных насосов тонопла-ста под влиянием ИУК [3]. Один из возможных механизмов этого влияния может быть связан, по аналогии с плазмалеммой [4], с наличием в тонопласте белка, способного взаимодействовать с этим фито-гормоном. Цель настоящего исследования состояла в выявлении среди белков вакуолярной мембраны тех, которые способны специфически связывать ИУК и, таким образом, претендовать на роль рецептора ИУК на тонопласте.
Вакуолярные мембраны получали после осмотического шока изолированных вакуолей, выде-
кДа 66
45
24
Электрофоретическое разделение ИУК-связываю-щих белков тонопласта в ПААГ с (по Лэммли). 1 -Белки-маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин - 66 кДа, яичный альбумин - 45 кДа, уреаза - 24 кДа. 2 - Белки тонопласта после специфической элюции 20 мМ ИУК с СКВг-активированной Сефарозы 4В, к которой в качестве лиганда присоединяли триптофан.
ленных из корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо в период покоя (хранение при 4°С). Вакуоли и вакуолярные мембраны выделяли из корнеплодов модифицированным макрообъем-ным способом [5]. Белки вакуолярной мембраны солюбилизировали буфером (20 мМ трис/MES, 1 мМ EDTA, 0.5% ß-меркаптоэтанола) с 1% октил-глюкозида (рН 7.4), встряхивая в шейкере в течение 30 мин при 4°С. ИУК-связывающие белки выделяли с помощью аффинной хроматографии на CNBr-активированной Сефарозе 4в, к которой в качестве лиганда присоединяли триптофан согласно [6]. Белки тонопласта наносили на колонку с этим сорбентом, уравновешенную 20 мМ трис/MES-буфе-ром (рН 7.4), и через 1.5 ч начинали элюцию не связанных с сорбентом белков, которые выходили из колонки одним большим пиком. В работе использовали хроматографическую систему LKB (Уви-корд, светофильтр 206 нм). Колонку в течение 2 ч промывали 20 мМ трис/MES-буфером (рН 7.4), содержащим 1 мМ KCl, а затем проводили специфическую элюцию тем же буфером, содержащим 20 мМ ИУК, при скорости потока 0.7 мл/мин. Выявленные белковые "пики" отбирали в пробирки. Белок осаждали 10% ТХУ и центрифугировали в течение 30 мин при 15000 g (центрифуга KR-22, Франция). Осажденные белки снимали буфером, содержащим 2% додецилсульфата Na (SDS) и 5% ß-меркаптоэтанола (рН 8.3), для последующего разделения с помощью электрофореза в полиа-криламидном геле (ПААГ) по Лэммли [7]. Гели после электрофореза окрашивали кумасси G-250 и нитратом серебра. Содержание белка определяли по методу Бредфорд [8]. Использовали трис, MES, ИУК, SDS, реактивы для электрофоретического разделения, белки-маркеры и октилглюкозид фирмы "Sigma" (США); ß-меркаптоэтанол фирмы "Merck" (Германия), CNBr-активированную Сефа-розу 4B фирмы "Pharmacia Fine Chemicals" (Швеция). Выход белка после специфической элюции 20 мМ ИУК был весьма невысоким и составлял в среднем 0.3% от всех белков тонопласта, нанесенных на колонку. Результаты электрофоретического разделения ИУК-связывающих белков тонопласта в ПААГ с SDS представлены на рисунке. Видно, что после специфической элюции ИУК с
ОБНАРУЖЕНИЕ ИУК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА НА ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЕ
315
аффинного сорбента сошел один белок с молекулярной массой 45 кДа.
Мы использовали методику, которая позволила ранее [6] выделить рецептор ауксина из проростков риса. Этот рецептор с молекулярной массой 57 кДа располагается на плазматической мембране. В настоящее время на мембранах, главным образом на плазматической, но также на мембранах эндоплазматического ретикулума и аппарата Голь-джи, обнаружен ряд белков, которые способны связывать ИУК и различаются своей молекулярной массой. Так, из проростков и листьев персика [9] выделен белок-рецептор ИУК с молекулярной массой 60 кДа, из проростков кукурузы - димер 21 кДа [10]. ИУК-связывающий белок гороха имел молекулярную массу 44 кДа [11]. Из плазматических мембран кабачка выделены две изоформы ИУК-свя-зывающего белка - 40 и 42 кДа [12]. Все эти белки с разной степенью доказательности могут быть потенциальными мембранными рецепторами ИУК. Рассматривалась возможность присутствия белка-рецептора ИУК на тонопласте [13], но данные о наличии такого белка на вакуолярной мембране нами не обнаружены. В настоящее время методами про-теомного анализа охарактеризованы десятки белков тонопласта [14, 15], но среди них нет белков, претендующих на роль рецепторов ИУК. В одном из последних обзоров [16] среди белков тонопласта, функциональная роль которых в настоящее время не установлена, приведен белок, названный gi/52353607, с молекулярной массой 45 кДа, как и у выделенного нами ИУК-связывающего белка. Следовательно, исходя из наших данных, можно предположить, что имеющийся на тонопласте белок с молекулярной массой 45 кДа может претендовать на роль рецептора ИУК, а также на участие в регуляции протонных насосов тонопласта и транспортных процессов, происходящих на этой мембране.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Романов Г.А. Рецепторы фитогормонов // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 4. С. 615-625.
2. Napier R. Plant hormone binding sites // Annals Botany. 2004. V. 93. P. 227-233.
3. Саляев Р.К., Озолина H.B., Прадедова ЕВ. Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тоно-
пласта в онтогенезе столовой свеклы // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 1. С. 5-8.
4. Шишова М.Ф. Мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 1999.
5. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я, Хаптагаев С Б., Ко-пытчук B.H. Выделение и очистка вакуолей и ва-куолярных мембран из клеток растений // Физиология растений. 1981. Т. 28. С. 1295-1305.
6. Kim Y.S., Kim D, Jung J. Isolation of a novel auxin receptor from soluble fractions of rice (Oryza sativa L.) shoots // FEBS Lett. 1998. V. 438. № 3. P. 241-244.
7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principles of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
9. Sugaya S., Ohmiya A., Kikuchi M., Hayashi T. Isolation and characterization of a 60 kDa 2,4-binding protein from the shoot apices of peach trees ( Prunus persica L.); it is a homologue of protein disulfide isomerase // Plant Cell Physiol. 2000. V. 41. № 4. P. 503-508.
10. Shimomura S, Sotobayashi T, Futai M, Futai T. Purification and properties of a auxin-binding protein from maize shoot membranes // J. Biochem. 1986. V. 99. № 5. P. 1513-1524.
11. Reinard T., Achmus H, Walther A., Rescher U., Klambt D, Jacobsen H.J. Assignment of the auxin binding abilities of ABP44 in gel // Plant Cell Physiol. 1998. V. 39. № 8. P. 874-878.
12. Hicks G.R., Rice M.S., Lomax T.L. Characterization of auxin-binding proteins from zucchini plasma membrane // Planta. 1993. V. 189. № 1. P. 83-90.
13. Dohrmann U, HertelR., KowalikH. Properties of auxin binding sites in different subcellular fractions from maize coleoptiles // Planta. 1978. V. 140. P. 97-106.
14. Clay C., Pan S., Zouhar J., Avila E.L., Girke T., Raikhel N.V. The vegetative vacuole proteome of Arabi-dopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 3285-3303.
15. Schmidt U.G., Endler A., Schelbert S., Brunner A., Schnell M., Neuhaus HE., Marty-Mazars D, Marty F., Baginsky S., Martinoia E. Novel tonoplast transporters identified using a proteomic approach with vacuoles isolated from cauliflower buds // Plant Physiol. 2007. V. 145. P. 216-229.
16. Endler A., Meyer S., Schelbert S., Schneider T, Weschke W, Peters S., Keller F, Baginsky S., Martinoia E, Schmidt U. Identification of a vacuolar sucrose transporter in barley and Arabidopsis mesophyll cells by a tonoplast proteomic approach // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 196-207.
Identification of the IAA-Binding Protein in Beetroot Tonoplasts
N. V. Ozolina, R. K. Salyaev, L. A. Sitneva, V. N. Nurminsky
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 664033 Irkutsk, P.O. box 317, Russia; Fax (3952) 510-754; e-mail: ozol@sifibr.irk.ru
IAA (Indole-3-acetic acid)-binding protein was isolated from beetroot tonoplasts by means of affinity chromatography using the tryptophan-attached Sepharose 4B columns as described in [Kim Y.S. et al. FEBS Lett. 1998. V. 438 (3). P. 241-244]. The yield of the tonoplast IAA-binding protein was very low and amounted 0.3% of all the tonoplast proteins applied to the column. This protein gave a single band on SDS-PAGE corresponding to a molecular mass of 45 kDa. Tonoplast proteomic approach showed that among the tonoplast proteins there is a 45-kDa protein with an unknown function. We suggest that the protein with molecular mass of 45 kDa may be the IAA receptor involved in the regulation of transport processes in tonoplasts.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ том 25 < 4 2008
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.