ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 5, с. 380-385
РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ ^^^^^^^^^^^^ РАЗВИТИЕ
УДК 591
ОБНАРУЖЕНИЕ КАРОТИНОИДОВ В СТЕКЛОВИДНОМ ТЕЛЕ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА В ПРЕНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ1
© 2007 г. М. А. Яковлева*, И. Г. Панова, Т. Б. Фельдман*, П. П. Зак*, А. С. Татиколов*,
Г. Т. Сухих**, М. А. Островский*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 *Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119991 ГСП-1, Москва, ул. Косыгина, д. 4 **ГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН 117997 Москва, ул. Академика Опарина, д. 4 E-mail: pinag@mail.ru Поступила в редакцию 01.11.07 г. Окончательный вариант получен 07.02.07 г.
В плодном периоде развития человека с 15-й по 28-ю нед в стекловидном теле глаза впервые были обнаружены каротиноиды. Их максимальное содержание приходится на 16-22-ю нед. В стекловидном теле глаз 31-недельных плодов каротиноиды уже не обнаруживаются. У взрослых людей каротиноиды в стекловидном теле также не обнаружили, что соответствует литературным данным. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что хроматографические характеристики этих каротиноидов соответствуют лютеину и зеаксантину, которые являются характерными пигментами желтого макулярного пятна сетчатки.
Ключевые слова: каротиноиды, макулярный пигмент, альбумин, стекловидное тело, сетчатка, хрусталик, развитие, спектрофотометрия, ВЭЖХ.
Известно, что сетчатка глаза человека содержит каротиноиды лютеин и зеаксантин - пигменты желтого цвета. Максимальная концентрация этих пигментов сосредоточена в ее макулярной области - желтом пятне (около 70% от их общего содержания в глазу). Им отводится роль светофильтра, защищающего зрительные клетки от повреждающего действия синего света, а также роль эффективных антиоксидантов (см. обзор: Трофимова и др., 2003). Помимо сетчатки лютеин и зеаксантин были найдены в цилиарном теле, радужке и хрусталике. В стекловидном теле зрелого глаза каротиноиды обнаружены не были (Bernstein et al., 2001).
Ранее в стекловидном теле у плодов человека мы обнаружили белок альбумин и показали возрастную динамику изменения его содержания на разных стадиях развития с максимальным значением во втором триместре (Панова, Татиколов, 2005; Panova et al., 2007). Функция альбумина в стекловидном теле в данный период развития остается неясной. На этих же стадиях развития
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 05-04-49945, 05-03-32775, 05-04-48502а, 05-04-48026а) и Программой ОБН РАН "Физиологические механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем".
стекловидное тело, по нашим наблюдениям, имеет желтоватый цвет, что могло бы быть обусловлено присутствием каротиноидов.
Исходя из представлений о функции альбумина как переносчика биологически важных макромолекул (жирные кислоты, гормоны, металлы, аминокислоты, каротиноиды и т. д.) (Peters, 1996), мы предположили, что альбумин, обнаруживаемый в стекловидном теле глаза плодов человека, переносит в него каротиноиды, необходимые для дифференцировки сетчатки и формирования желтого пятна. Цель работы - обнаружение и исследование каротиноидов в стекловидном теле глаза человека в ходе пренатального развития.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Стекловидное тело из глаз абортивных плодов человека исследовали с 13-й по 31-ю нед беременности. Плоды поступали в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН из лицензированных учреждений Минздрава, действующих в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан и в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний. Возраст плодов определялся врачом-
акушером. Под бинокулярной лупой МБС-9 отрезали по лимбу роговицу и вынимали стекловидное тело вместе с хрусталиком, после чего аккуратно удаляли хрусталик и очищали стекловидное тело от остатков сетчатки. Стекловидное тело взрослых людей в возрасте 21, 25 и 48 лет выделяли из кадаверных глаз после забора роговицы для пересадки. Полученные таким образом образцы хранили при температуре -20°С до проведения дальнейшего исследования.
Прозрачность стекловидного тела оценивали на микроскопических препаратах с помощью микроспектрофотометра (Говардовский, Зуева, 2000) в диапазоне длин волн 350-750 нм с пороговой чувствительностью от 0.005 единиц оптической плотности.
Для обнаружения каротиноидов в нативном стекловидном теле образцы, полученные от плодов человека, были разбиты на три возрастные группы в зависимости от степени желтизны (табл. 1). Первая - 15 нед (8 глаз), вторая - от 16 до 22 нед (12 глаз), третья - с 24-й по 28-ю нед беременности (6 глаз). В каждой возрастной группе образцы стекловидного тела для исследования были объединены между собой. Четвертую группу составило стекловидное тело 21-летнего человека (1 глаз). После предварительного взвешивания на весах ВР 310 S ("САРТОГОСМ", Россия) измеряли спектры поглощения нативного стекловидного тела на спектрофотометре UV-1700 ("Shimadzu", Япония) в 1-см кювете в диапазоне 370-670 нм, затем эти же образцы использовали для проведения анализа на присутствие и состав каротиноидов с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого проводили экстракцию из нативного стекловидного тела в системе хлороформ : метанол : вода в соотношении 2 : 1 : 1 (по объему). Смесь центрифугировали на центрифуге MLW K 26 D (680 g, 10 мин, 4°С), отбирали нижний хлороформный слой и упаривали его на водоструйном насосе. Осадок растворяли в 100 мкл метанола непосредственно перед проведением анализа ВЭЖХ. Для анализа использовали аликвоту 30 мкл. Для хрома-тографического разделения применяли хромато-графическую установку ("Knauer", Германия) и колонку Диасфер 120 С18 (4 х 120 мм, размер сорбента 5 мкм). Разделение проводили путем линейного градиентного элюирования в системе от 100%-го растворителя А (10% метанола + 90% ацетонитри-ла) до 100%-го растворителя В (100%-ный этилаце-тат) за 70 мин. Детекцию осуществляли при длине волны 430 нм с помощью детектора Knauer К-2501, в качестве стандарта использовали смесь лютеина и зеаксантина ("La Roch", Швейцария).
Были также исследованы спектры поглощения супернатантов, полученных после центрифугирования в центрифуге Eppendorf 5417R нативного стекло-
Таблица 1. Визуальная характеристика стекловидного тела глаза человека в развитии
Возраст плодов, нед Визуальная характеристика стекловидного тела
13.0 Прозрачное, бесцветное, пронизано сосудами гиалоидного кровоснабжения, заполненными кровью
14.0 15.0 15/16 Прозрачное, светло-желтое, видны сосуды, заполненные кровью
16 16/18 18/19 19 Прозрачное, желтое, иногда светло-желтое, сосудов, заполненных кровью заметно меньше, они, главным образом, в сосудистой сумке хрусталика
20/22 21/22 23.0 Прозрачное, желтое или светло-желтое, сосудов мало. Как правило, виден один сосуд главной гиалоидной артерии в области выхода глазного нерва и сосуды сосудистой сумки хрусталика
24 26/28 31 Прозрачное, практически бесцветное, сосуды, как правило, не обнаруживаются. Иногда видны лишь остатки сосудистой сумки хрусталика
видного тела (12500 об/мин, 4°С, 30 мин) на сроках 16/18, 24, 26/28, 31 нед беременности и для сравнения от взрослых людей в возрасте 25 и 48 лет. Аликвоты по 50 мкл от каждого образца измеряли на спектрофотометре UV-3101PC ("Shimadzu", Япония) в 1-мм кювете в диапазоне 300-600 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Визуально и с помощью бинокулярной лупы МБС-9 выяснили, что у 13-недельных плодов стекловидное тело представляет собой прозрачный бесцветный гель, интенсивно пронизанный гиалоидными кровеносными сосудами. На сроках 14, 15 и 15/16 нед беременности оно прозрачное, уже имеет светло-желтый цвет и густую сеть гиало-идных сосудов. На сроках от 16 до 23 нед беременности отмечен желтый либо иногда светло-желтый цвет стекловидного тела. Начиная с 24-й и далее до 31-й нед стекловидное тело прозрачное, но при этом бесцветное и практически лишено сосудов. При выделении стекловидного тела вместе с хрусталиком четко просматривались передняя и задняя сосудистая сумка хрусталика (табл. 1). Стекловидное тело взрослого человека бесцветное, прозрачное и полностью лишено кровеносных сосудов.
При микроспектрофотометрических измерениях обнаружено, что желтоватый по цвету гель стекловидного тела имеет гомогенную прозрач-
Рис. 1. Спектральная характеристика стекловидного тела глаза плодов человека на разных сроках беременности: а -спектры поглощения образцов нативного стекловидного тела, объединенных на 15-й (1), 16-22-й (2) и 24-28-й (3) нед беременности; • - спектры поглощения супернатанта стекловидного тела плодов человека на 16/18-й (1), 24-й (2), 26/28-й (3) и 31-й (4) нед беременности. По оси абсцисс - длина волны, нм; по оси ординат - оптическая плотность.
тела (табл. 1), показывают наличие широких полос в области 450-470 нм. Такие спектры характерны для каротиноидов. У плодов разных сроков беременности содержание каротиноидов в стекловидном теле, судя по спектрам, различно. Их наибольшая концентрация приходится на 16-22-ю нед беременности (рис. 1, а, 2), что соответствует наибольшей желтизне стекловидного тела (табл. 1). На сроках 15 и 24-28 нед беременности (рис. 1, а, 1 и 3 соответственно) концентрация каротиноидов значительно ниже.
Спектральное исследование супернатантов стекловидного тела на сроках 16/18, 24, 26/28, 31 нед беременности и супернатантов от взрослых людей в возрасте 25 и 48 лет показало, что полосы поглощения в области 450-470 нм присутствовали только у 16/18, 24 и 26/28-недельных плодов, причем максимальное поглощение наблюдали на 16/18-й нед, а на стадиях 24 и 26/28 нед беременности оно последовательно снижалось (рис. 1, б, 1-3). На 31-й нед поглощение в этой области практически отсутствовало (рис. 1, б, 4).
Как в нативном стекловидном теле глаза 21-летнего человека, так и в супернатантах таковых у людей 25 и 48 лет поглощение в этой области, характерное для каротиноидов, также отсутствовало. Следует отметить, что в спектрах поглощения стекловидного тела, полученн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.