МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 5, с. 716-720
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8.017.73
ОБНАРУЖЕНИЕ КУЛЬТИВИРУЕМОЙ ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНОЙ АРХЕИ РОДА ЗиЬЕОРНОБОСОССШ В МЕТАНТЕНКЕ, РАБОТАЮЩЕМ В ТЕРМОФИЛЬНОМ РЕЖИМЕ
© 2004 г. Г. Б. Слободкина, А. И. Слободкин, Т. П. Турова, Н. А. Кострикина, Е. А. Бонч-Осмоловская
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 03.11.2003 г.
Из сброженного ила метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных сточных вод в термофильном режиме (50°С), была получена устойчивая ассоциация гипертермофильных микроорганизмов (82°С), состоящая из численно доминирующих кокков и минорного количества бесспоровых палочек. ПЦР-амплификация генов 168 РНК общей геномной ДНК, выделенной из этой ассоциации с помощью архей-специфичных праймеров, и секвенирование полученного продукта выявили, что архейный компонент представлен единственной нуклеотидной последовательностью, имеющей 99.9% гомологию с геном 168 РНК Sulfophobococcus zШgu. Это первое сообщение об обнаружении гипертермофильных архей в системе анаэробной биологической очистки. Кроме того, это первое сообщение об обнаружении культивируемого представителя царства СгепагЬаео1а в антропогенных местообитаниях с нейтральным значением рН.
Ключевые слова: гипертермофильная архея, Sulfophobococus, метантенк.
Природными местообитаниями гипертермофильных микроорганизмов (температурный оптимум роста выше 80°С) являются пресноводные и морские гидротермы различного типа, а также геотермально нагреваемые подземные воды [1, 2]. Известны случаи выделения гипертермофильных архей из холодной морской воды [3, 4], где они способны длительное время выживать, вероятно, после попадания туда из подводных гидро- или геотермальных систем. Хотя термофильные микроорганизмы, способные к развитию при 60-70°С и представленные в основном спорообразующи-ми формами, рутинно выделяются из различных нетермальных биотопов, таких как почва, осадки водоемов и кишечный тракт животных [5], об обнаружении гипертермофильных прокариот в подобных местообитаниях не сообщалось.
Примерами микробных местообитаний, созданных деятельностью человека и имеющих повышенную температуру, являются кучи саморазогревающихся органических материалов (компост, зерно, торф, уголь), системы горячего водоснабжения, сооружения биологической очистки, работающие в термофильном режиме. К настоящему времени наиболее высокотемпературными микроорганизмами, развивающимися в антропогенных биотопах, считаются бактерии рода Thermus и Hydrogenobacter с максимальной температурой роста до 80°С, обнаруженные в компосте, и ацидофильная кренархеота Metallosphaera prunae, выделения из тлеющего шлакового отвала урано-
вой шахты и оптимально растущая при 75°С [6-8]. Несмотря на то что микрофлора систем биологической очистки, в том числе и термофильных ме-тантенков, исследуется как культуральными [9], так и молекулярно-экологическими методами [10], случаи обнаружения в них культивируемых гипертермофильных микроорганизмов или нуклеотид-ных последовательностей генов 168 рРНК, относящихся к гипертермофилам, неизвестны.
В настоящей работе мы сообщаем об обнаружении культивируемого представителя гипертермофильного архейного рода Sulfophobococcus в сброженном иле метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных стоков в термофильном режиме, и приводим некоторые физиологические характеристики этого микроорганизма.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор проб. Пробы сброженного осадка были отобраны из метантенка работающего в термофильном режиме (52.6°С), и обрабатывающего активированный ил после очистки муниципальных сточных вод на Курьяновской станции аэрации (Москва). Пробы хранили в плотно закрытых банках при -4°С 18 ч до начала получения накопительной культуры.
Состав сред и культивирование. Среда для получения культур гипертермофильных микроорганизмов имела следующий состав (на 1 л дистил-
ПЦР праймеры, использованыне в данной работе и результаты амплификации
Приблизительный размер продукта амплификации (п.н.)
Праймер Нуклеотидная последова- Специфичность, Накопительная культура
тельность (5'-3') ссылка Проба После 3 пересевов на среде с Fe(III) После 5 пересевов КР4
Un515F GUGBCAGCMGCCGCGG UAA GGTTACCTTGTTACGAC TT Ген 168 рРНК всех прокариот, [16] 980 980 980 980
Arch 2F GGCCCTAYGGGGYGCAS CAGGC GCGGTGTGTGCAARG CAGGG Ген 168 рРНК архей, [16] 960 960 960
Cren 7F TTCCGGTTGATCCYGCC Ген 168 рРНК - 510 510 510
Cren518R GGACC GCTGGTWTTACCGCGGC GGCTGA кренархеот, [14]
TcPc173F TCCCCCATAGGYCTGRG Ген 168 рРНК - - - -
TcPc589R GTACTGGAAGGTC GCCGTGRGATTTCGCCA семейства ТЬегшососсасеае, [15]
GGGACTTACGGGC
Примечание. Размер продуктов амплификации выражен в количестве пар нуклеотидов. Знак "-" обозначает отсутствие продуктов амплификации.
лированной воды): NH4Cl - 0.33 г, KCl - 0.33 г, MgCl2 ■ 6H2O - 0.33 г; KH2PO4 - 0.33 г; NaHCO3 - 2 г; раствор микроэлементов [11] 1 мл; раствор витаминов [12] 1 мл; дрожжевой экстракт ("Sigma") 0.2 г, пептон 10 г. Среды готовили анаэробно, разливали в пробирки Хангейта под током CO2 (100%) и стерилизовали автоклавированием при 2 атм, 1 ч. Среда не содержала никаких восстанавливающих агентов. pH автоклавированной среды составлял 6.7-6.9 при 20°C. Начальные накопительные культуры культивировали на среде вышеописанного состава, в которую был дополнительно добавлен аморфный оксид железа(Ш) (90 мМ), приготовление которого описано ранее [13].
Для получения колоний десятикратные серийные разведения высевали в расплавленные столбики агаризованной (2.5% Bacto Agar) анаэробной среды того же состава, содержащейся во флаконах объемом 20 мл, заполненных CO2 (100%) и закрытых резиновыми пробками и алюминиевыми крышками. После застывания агара флаконы инкубировали при температуре 82°C. Выросшие отдельные колонии отбирали шприцом и культивировали в жидкой среде. Если не оговорен иначе, культивирование проводили при 82°C.
Чистая культура Sulfophobococcus zilligii DSM 11193T была получена из Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) и культивировалась согласно инструкциям DSMZ (www.ssmz.de) на соответствующей среде (media 770).
Световая и электронная микроскопия. Наблюдения и подсчет клеток проводили с помощью светового фазово-контрастного микроскопа (ЛОМО АУ-12, Россия). Трансмиссионная электронная микроскопия была выполнена на электронном микроскопе JEM-100C.
Выделение ДНК, амплификация и сиквенс 16S рРНК генов. Выделение и очистку геномной ДНК, селективную ПЦР амплификацию гена 16S рРНК и определение его нуклеотидной последовательности проводили методами описанными ранее [13]. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПЦР-анализа накопительной культуры, представлены в таблице. Реакции амплификации проводили в условиях, описанных ранее [14-16].
1
Рис. 1. Электронные фотографии культуры КР4. Негативное окрашивание ФВК. Длина масштабной линейки - 1 мкм.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов. Пробы сброженного осадка из ме-тантенка (1 мл), были внесены в пробирки Хангейта, содержащие 10 мл стерильной анаэробной среды с аморфным оксидом Ре(Ш) и инкубированы при 82°С. Через 7 сут культивирования, в инокулирован-ных вариантах, наблюдалось преобразование бурого немагнитного аморфного оксида Ре(Ш) в черный магнитный осадок меньшего объема, вызванное восстановлением окисного железа в закисное. После трех последовательных 5%-ных пересевов на среду того же состава, накопительная культура устойчиво восстанавливала Ре(Ш) в Ре(П), и являла собой смесь кокков и 2-3 морфологических типов бесспоровых палочек, представленных в приблизительно равном соотношении. Дальнейшие исследования были направлены на получение культуры кокков, которые с большой долей вероятности могли являться археями. Преобладающий рост микроорганизмов коккоидной формы удалось получить при культивировании на среде, не содержащей аморфного оксида Ре(Ш). В 10-кратных серийных разведе-
ниях на жидкой среде рост наблюдался только в 10-1 разведении. На агаризованной среде в 10-3 и 10-4 разведениях были получены отдельные бесцветные колонии 0.4-0.7 мм в диаметре. Девять колоний были отобраны и инкубированы в жидкой среде при 82°С в течение восьми сут. Световая и электронная микроскопия полученных культур выявила доминирование кокков правильной формы 2-5 мкм в диаметре, встречающихся либо в виде отдельных клеток либо их пар, а также небольшое количество бесспоровых палочек (не более 2% от количества кокков) (рис. 1). Повторение процедуры получения отдельных колоний и их культивирование на жидкой среде привело к тем же результатам. Мы предположили, что данная культура представляет собой устойчивую ассоциацию двух микроорганизмов, возможно, основанную на симбиотических отношениях, и кок-ковидный компонент не может быть получен в чистой культуре. Эта смешанная культура получила обозначение КР4.
ПЦР-анализ накопительных культур. На разных этапах очистки накопительной культуры гипертермофильных микроорганизмов из культуры выделяли общую геномную ДНК и проводили ПЦР-анализ с олигонуклеотидными праймерами специфичными к 168 рРНК генам архей, кренар-хеот, ТЪегшососсасеае, а также с универсальными (таблица). В исходной пробе сброженного ила, отобранного из метантенка, сигнал ПЦР был обнаружен только с универсальными праймерами. В накопительных культурах после трех последовательных пересевов на среде, содержащей аморфный оксид Ре(Ш), после пяти пересевов на среде без железа, и в культуре КР4 продукты ПЦР наблюдались в реакциях со всеми праймерами кроме праймеров, специфичных к ТИегшосос-сасеае. В реакциях с каждой парой праймеров положительный результат ПЦР представлял собой единственный продукт ожидаемого размера.
Амплификация и сиквенс генов 168 рДНК.
С помощью АгсИаеа-специфичных праймеров [17] была проведена селективная ПЦР-амплифика-ция гена 168 рРНК общей геномной ДНК, выделенной из накопительной культуры КР4. Секвени-рование полученного продукта (884 нуклеотидов) выявило, что архейный компонент представлен единственной нуклеотидной после
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.