ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 438, № 3, с. 419-421
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.115:577.352
ОБНАРУЖЕНИЕ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ РАФТОВ В ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЕ
© 2011 г. Н. В. Озолина, И. С. Нестёркина, В. Н. Нурминский, А. В. Степанов, Е. В. Колесникова, В. В. Гурина, член-корреспондент РАН Р. К. Саляев
Поступило 12.01.2011 г.
Известная модель Зингера—Никольсона, согласно которой белки "плавают" в однородном липидном море, в настоящее время претерпела значительные изменения. Сегодня общепринято, что клеточные мембраны крайне неоднородны: в них присутствуют различные липид-белковые структуры, которые являются участниками многих метаболических процессов, протекающих в живой клетке [1]. В настоящее время наибольшее распространение приобрела модель липид-бел-ковых микродоменов (рафтов), согласно которой вокруг определенных белков возникают области, обогащенные гликосфинголипидами, стеринами и липидами с насыщенными жирными кислотами, где липиды характеризуются более плотной упаковкой молекул по сравнению с окружающими их участками мембран [2].
Интерес к рафтам вызван тем, что появляется все больше экспериментальных данных, подтверждающих их участие в таких жизненно важных клеточных процессах, как внутриклеточная передача сигналов, эндоцитоз, апоптоз, сортировка белков, интернализация токсинов, бактерий, вирусов и т.д. [3, 4]. Кроме специфического липид-ного состава, эти мембранные домены характеризуются и определенным белковым профилем. В рафтах плазматических мембран растений идентифицированы АТФазы Р- и У-типов, проте-инкиназы, мономерные и гетеромерные О-бел-ки, белки 14-3-3-семейства, аквапорины и др. [5].
В настоящее время рафты обнаружены в плазматической мембране, в мембранах эндоплазматиче-ского ретикулума и аппарата Гольджи. Мембраны митохондрий рафтов не содержат [6]. Данные по липидному составу тонопласта [7] позволяют предположить, что вакуолярная мембрана растений также может содержать белок-липидные рафты. В настоящей работе были обнаружены липид-белковые домены (рафты) в вакуолярной мембране.
Эксперименты проводили на изолированных вакуолях и мембранных везикулах корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо, находящихся на стадии покоя. Выделение и очистку вакуолей и везикул тонопласта из ткани корнеплодов проводили методом [8]. Стерин-обогащенные микродомены (рафты) выявляли методом флуоресцентной микроскопии с использованием стерин-связывающего антибиотика филипина [9]. Для связывания филипина с вакуолярной мембраной
Градиент
сахарозы, % ■
15
25
35
45
60
Плотность, г/см3
1.050
1.083
1.110
1.134
1.154
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск
Рис. 1. Распределение мембранного материала, солю-билизированного 1%-ным тритоном Х-100, после центрифугирования (200000 g, 18 ч) в градиенте плотности сахарозы (15—60%).
419
9*
420
ОЗОЛИНА и др.
Рис. 2. Микрофотографии изолированных вакуолей после инкубации с 5 мкМ филипином. Стрелками указаны зоны стерин-обогащенных микродоменов. Масштабная линейка — 5 мкм.
к суспензии изолированных вакуолей в среде выделения (0.8 М KCl, 20 мМ ЭДТА, 50 мМ Na2HPO4, рН 8.0) добавляли филипин (0.2%-ный раствор в ДМСО) до конечной концентрации 5 мкМ, суспензию инкубировали при 20 ± 2°С в течение 30 мин, отмывали тем же буфером и анализировали на флуоресцентном микроскопе Axio observer Z1 ("Carl Zeiss", Германия) с цифровой монохромной камерой Axio Cam MRm и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображения Axio Vision Rel. 4.8 с использованием блока светофильтров № 49 (EX 6365; BSFT395; EMBP 445/50). Детергент-устойчивые фракции то-нопласта выделяли центрифугированием (200000 g, 18 ч) после предварительной солюбилизации ваку-олярных мембран 1%-ным тритоном Х-100, 30 мин при 4°С. Из зоны опалесценции (в районе 25%-ной сахарозы), содержащей стерин-обога-щенные микродомены, экстрагировали липиды по методу [10]. Хроматографическое разделение нейтральных липидов проводили по методу [11],
Рис. 3. Полярные (А) и нейтральные (Б) липиды вакуолярных мембран (а) и стерин-обогащенных микродоменов (б). А: 1 — старт; 2, 5 — цереброзиды; 3 — фосфатидилинозит; 4 — фосфатидилхолин; 6 — фосфатидилэтаноламин; 7, 8 — лактоцереброзиды; 9 — фосфатидилглицерин; 10, 11 — моно- и дигалактозилдиглицериды; 12 — нейтральные липиды. Б: 1 — полярные липиды; 2 — жирные кислоты; 3 — свободные стеролы; 4 — триглицириды; 5 — высшие алифатические метилкетоны; 6 — метиловые эфиры жирных кислот; 7 — алкилдиглицириды; 8 — стерольные эфиры; 9 — свободные углеводороды.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 438 № 3 2011
ОБНАРУЖЕНИЕ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ РАФТОВ
421
полярных — по методу [12]. Идентификацию полярных липидов проводили по методу [13].
На рис. 1 представлены результаты разделения в градиенте сахарозы (15—60%) тритон-солюбилизи-рованной фракции тонопласта. Хорошо заметна белая, опалесцирующая зона, за которую ответственны стерин-обогащенные микродомены (рафты) [5]. Она расположена в районе 25%-ного градиента сахарозы, плотность раствора 1.083. При выделении рафтов по аналогичной методике из плазматических мембран листьев табака [14] и корней подорожника [5] рафты в виде аналогичной, опалес-цирующей зоны были обнаружены в другом слое градиента, соответствующем 30—35%-ной сахарозе, плотность раствора 1.110. Эти отличия могут быть связаны с биохимическими особенностями тонопласта, который имеет другое липид-белковое соотношение и другой качественный и количественный состав белков и липидов.
Для подтверждения присутствия в вакуоляр-ной мембране рафтов изолированные вакуоли инкубировали с флуоресцентным антибиотиком филипином, который избирательно взаимодействует со стерин-обогащенными областями мембран. На рис. 2, полученном с помощью флуоресцентной микроскопии, видны зоны, связывающие филипин, что может свидетельствовать о присутствии в вакуолярной мембране специфических липид-белковых микродоменов. По литературным данным размеры рафтов колеблются от 10 до 700 нм [15], но в живой клетке отдельные мембранные домены могут взаимодействовать между собой с образованием кластеров больших размеров, что рассматривается как один из механизмов регуляции активности белков, находящихся в рафтах.
Хорошо известно, что среди липидов рафтов преобладают сфинголипиды, стерины и липиды с насыщенными жирными кислотами. Для характеристики липидов рафтов вакуолярных мембран из опалесцирующей зоны после разделения три-тон-солюбилизированных белков в градиенте сахарозы экстрагировали липиды и изучали их состав. На рис. 3 приведены данные двумерной тонкослойной хроматографии, которые показывают, что среди полярных липидов в зоне предполагае-
мых рафтов полностью отсутствуют такие фосфо-липиды, как фосфатидилинозит, фосфатидилэта-ноламин и фосфатидилглицерин, но значительно больше сфинголипидов (цереброзидов) по сравнению с полярными липидами вакуолярных мембран. Среди нейтральных липидов в предполагаемой зоне рафтов преобладали свободные стеролы и углеводороды, тогда как спектр нейтральных липидов тонопласта был значительно более насыщенным.
Таким образом, полученные результаты указывают на присутствие в вакуолярной мембране ли-пид-белковых рафтов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pike L.J. // J. Lipid Res. 2009. V. 50. P. 323-328.
2. Sudha M., Preeti G. // J. Neurochemistry. 2007. V 103. Suppl. P. 135-142.
3. Brown D.A., London E. // Annu. Rev. Cell and Develop. Biol. 1998. V. 14. P. 111-136.
4. Suomalainen M. // Traffic. 2002. V. 3. № 10. P. 9961003.
5. Lefebvre B., Furt F, Hartmann M.-A., et al. // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 402-418.
6. Zbeng Y. Berg K, Foster L. // J. Lipid Res. 2009. V. 50. № 5. P. 988-998.
7. Макаренко С.П., Конёнкина Т.А., Саляев Р.К. // Биол. мембраны. 1992. Т. 9. № 3. С. 290-300.
8. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Хаптагаев С.Б., Ко-пытчук В.Н. // Физиология растений. 1981. Т. 28. № 6. С. 1295-1305.
9. Liu P., Li R-L., Zbang L., Wang Q.-L., et al. // Plant J. 2009. V 60. P. 303-313.
10. Bligh E., Dyer W. // Canad. J. Biochem. and Physiol. 1959. V. 37. P. 911-917.
11. Копытов Ю.П. // Экология моря. 1983. № 13. С. 76-80.
12. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Литвинова Л.С. и др. // Биоорган. химия. 1984. Т. 10. С. 244-254.
13. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.X., Vasendin J.M. // J. Chromatogr. 1975. V. 114. P. 129-144.
14. Mongrand S, Morel J., Laroche J., Claverol S. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 36277-36286.
15. Jacobson K., Ditrich C. // Trends Cell Biol. 1999. V. 9. P. 87-91.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 438 № 3 2011
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.