ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.284
ОБНАРУЖЕНИЕ QUAMBALARIA CYANESCENS В АССОЦИАЦИИ
С БЕРЕЗОЙ ПОВИСЛОЙ
© 2014 г. А. Б. Антропова*, ^ Е. Н. Биланенко**, В. Л. Мокеева**, Л. Н. Чекунова**, А. В. Качалкин**, О. В. Штаер**, О. В. Камзолкина**
*ФГБУНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва **Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 10.12.2013 г.
Многолетние микробиологические исследования пыльцы березы повислой, произрастающей на территории Москвы и Московской области, показали, что около трети проанализированных образцов содержат гриб, идентифицированный нами по морфолого-культуральным и молекулярно-генетиче-ским критериям как Quambalaria cyanescens (de Hoog & G.A. de Vries) Z.W de Beer, Begerow & R. Bauer. Данный вид ранее был известен преимущественно как симбионт тропических растений родов Eucalyptus и Corymbia и на территории России раньше не выделялся. Нами впервые установлена тесная ассоциация вида Q. cyanescens с березой повислой. Показано, что микромицет регулярно обнаруживается не только в пробах пыльцы, но на поверхности и внутри сережек, на поверхности листьев и веток березы, при этом не выделяется с других видов растений из районов проведенного исследования. В статье приведены морфолого-культуральные характеристики, особенности ультраструктуры клеток, данные по встречаемости гриба, а также филогенетический анализ выделенных штаммов.
Ключевые слова: Quambalaria cyanescens, Betula pendula, береза повислая, пыльца березы, Microstromatales, Ustilaginomycotina.
DOI: 10.7868/S0026365614050036
Хорошо известно, что жизненный цикл мик-ромицетов зачастую тесно связан с растениями, а характер биоценотических связей варьирует от симбиоза до паразитизма. Однако далеко не всегда ареал гриба определяется ареалом растения-хозяина. Неизменный интерес вызывают вопросы о том, насколько сильна приуроченность тех или иных грибов к конкретному растению и о характере их взаимоотношений. Так, в 2007 г. в результате изучения микромицетов, присутствующих на пыльце различных растений, нами в образцах пыльцы березы повислой, собранных в разных районах Москвы и Московской области, обнаружен в значительной численности гриб Quambalaria cyanescens (de Hoog & G.A. de Vries) Z.W. de Beer, Begerow & R. Bauer [1]. Первое описание этого вида как Sporothrix cyanescens de Hoog & G.A. de Vries, выделенного с кожи человека, относится к 1973 г. [2]. В 1987 г. в результате обнаружения в клетках гриба долипоровой септы и ко-энзима Q-10 он был отнесен к новому роду бази-диомицетов (Cerinosterus cyanescens (de Hoog & G.A. de Vries) R.T. Moore, Basidiomycota). В 2003 г. на основании молекулярно-генетических исследований LSU рДНК был описан род Fugomyces с
1 Автор для корреспонденции (e-mail: antropova-a@yandex.ru).
типовым видом Fugomyces cyanescens (de Hoog & G.A. de Vries) Sigler в порядке Microstromatales. Дальнейшие молекулярные исследования региона ITS рДНК в комплексе с исследованиями LSU рДНК и данными ультраструктурного анализа позволили выделить новое семейство Quambalari-aceae (Microstromatales, Exobasidiomycetidae, Exoba-sidiomycetes, Ustilaginomycotina, Basidiomycota), в которое был перемещен вид F. cyanescens под новым названием Q. cyanescens [3]. К настоящему моменту известны обнаружения вида в разных странах в воздухе, в почве, в ассоциации с насекомыми, отмечены клинические изоляты (www.cbs.knaw.nl). Однако, в первую очередь, этот микромицет известен как симбионт растений близкородственных родов Eucalyptus и Corymbia [3—6]. Неожиданная находка этого гриба на березе повислой побудила нас продолжить исследование по уточнению его распространения, встречаемости, численности и локализации.
Настоящая статья — первое полноразмерное сообщение об обнаружении Q. cyanescens в ассоциации с березой повислой.
Цель исследования — провести филогенетический анализ и генетическое сравнение различных штаммов Q. cyanescens, выделенных с березы по-
7
605
вислой, изучить особенности ультраструктуры и встречаемость гриба на березе в Москве и Московской области.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили в период с 2007 г. по 2012 г. Проанализировано 112 образцов пыльцы березы повислой (B. pendula), произрастающей в разных районах и разных биотопах Москвы и Московской области. Исследованные деревья не имели видимых признаков грибных поражений. Пробы пыльцы собирали следующим образом. Непосредственно перед началом цветения (конец апреля—начало мая) с деревьев на высоте до 2.5 м срезали веточки с нераскрывшимися сережками. С одного дерева срезали по 5—20 веток с 20—50 сережками. Веточки ставили в стерильные емкости с водой и помещали в предварительно простерили-зованный ламинарный бокс, в котором раскладывали стерильные листы бумаги. По мере раскрывания цветов опавшую пыльцу собирали в стерильные микропробирки для дальнейшего исследования. Одной пробой считали пыльцу, собранную с одного дерева. Пыльцу суспендировали в воде и сеяли в разведениях 1 : 10, 1 : 20, 1 : 50, 1 : 100. Для сравнения анализировали пробы пыльцы других растений с сережковидными тирсами — лещины обыкновенной (82 образца) и ольхи серой и черной (22 образца), а также травянистых растений — ежи сборной (37 образцов) и тимофеевки луговой (17 образцов). В букеты злаков собирали стебли с нераспустившимися соцветиями, около 100—300 стеблей с растущих рядом дерновин.
Для выяснения локализации Q. cyanescens на березе, а также возможных путей ее попадания в пробы пыльцы, проводили посев мужских соцветий, веточек и листьев. Ветки (с 50 берез) и тирсы (с 50 берез) собирали как одновременно со сбором пыльцы, так и в другие сезоны, листья (с 34 берез) — весной сразу после их раскрывания, летом и осенью. Собранные образцы раскладывали на питательные среды. Также анализировали внутреннее содержимое мужских соцветий. Для этого была выбрана модельная береза, в пробах пыльцы которой обнаруживалась Q. cyanescens. Собранные с модельной березы тирсы подвергали поверхностной стерилизации с помощью 5% раствора гипохлорита натрия в течение 4.5 мин с последующей промывкой в двух водах. После этого сережки растирали в ступке и переносили на питательные среды.
Посевы пыльцы, веток, соцветий и листьев осуществляли на среды Чапека (NaN03 — 2 г, КН2Р04 - 1 г, MgSO4 • 7H2O - 0.5 г, KCl - 0.5 г, FeSO4 — 0.01 г, сахароза — 20 г, агар — 20 г, дистиллированная Н20 — 1 л) и ксерофильную (сусло 16°Б — 200 мл, NaCl - 100 г, агар — 20 г, дистиллиро-
ванная Н2О — 800 мл). Результаты учитывали через 7 —10 дней инкубации в термостате при T = 25 ± 1°С, оптимальной или близкой к таковой для большинства мицелиальных грибов. Микро-мицеты выделяли в чистую культуру и идентифицировали по морфолого-культуральным и молекулярно-генетическим признакам.
Численность микромицетов в пыльце пересчитывали на 1 г. Встречаемость рассчитывали как число проб, в которых встретился гриб, выраженное в процентах по отношению к общему числу проб.
Морфолого-культуральные признаки оценивали на средах Чапека, сусло агаре (сусло 16°Б — 150 мл, агар — 20 г, дистиллированная Н2О — 850 мл), овсяном агаре (овсяная мука — 30 г, агар — 20 г, дистиллированная Н2О — 1 л), картофельно-глюкоз-ном агаре (картофель — 200 г, глюкоза — 20 г, агар — 20 г, дистиллированная Н2О — 1 л), глюкозо-дрожжевом агаре (глюкоза — 5 г, дрожжевой экстракт - 0.5 г, КН2РО4 - 0.2 г, MgSO4 • 7H2O -0.2 г, агар — 20 г, дистиллированная Н2О — 1 л).
Генетическую идентификацию выделенных штаммов, определенных по морфологическим признакам как Q. cyanescens, проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов LSU рДНК. Тотальную ДНК выделяли из 4-6-суточ-ных культур с помощью стеклянной дроби (300500 мкм диаметр), инкубации при 65°C в течение 1 ч в лизирующем буфере (Tris Base 50 мМ, NaCl 250 мМ, ЭДТА 50 мМ, SDS 0.3%, pH 8) и замораживания культур. Амплификацию регионов рДНК проводили с использованием праймеров ITS1f (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA), NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО "Евроген", Москва). Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием набора BigDye XTerminator Purification Kit ("Applied Biosystems", США). Для секвенирова-ния использовали праймеры ITS1f и NL4. Секве-нирование фрагментов рДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", США) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer в Научно-производственной компании "Синтол" (Москва). Для филогенетического анализа полученных результатов использовали пакет программ MAFFT 6 [7] и MEGA4 [8]. Сиквенсы для построения филогенетического дерева были взяты из статей с описаниями и данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Полученные в ходе выполнения работы си-квенсы нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов LSU рДНК для штаммов Q. cyanescens размещены в генобан-
ках ENA и NCBI под номерами доступа HG799001—HG799003.
Генетическое сравнение выборки выделенных штаммов было проведено методом ДНК портре-тирования штаммов с использованием ПЦР анализа с неспецифичным праймером M13. Выделение ДНК осуществляли по методике, описанной выше. Проведение амплификации и электрофорез осуществляли по методике, опубликованной ранее [9].
Образцы для сканирующей электронной микроскопии (блок верхнего слоя агара с грибом, 1 см2) фиксировали в течение 1 ч в 2.5% растворе глютарового альдегида, приготовленного на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2), с последующим трехкратным промыванием в буфере (по 20 мин). Обезвоживали в растворах этилового спирта (30, 50, 70 и 96% концентрации) и в ацетоне с последующим высушиванием при критической точке в атмосфере CO2, напылением углеродом и металлом. Исследовали гриб в сканирующем электронном микроскопе JSM-6380 (Япония).
Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) образцы поверхностно растущего мицелия и/или дрожжевые клетки на 3—5 сут роста на мальт-агаре фиксиро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.