ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН, Том 2, №2, 2006, стр. 75-78
БИОЛОГИЯ
УДК 582.232 + 543.42.061
ОБНАРУЖЕНИЕ ТОКСИНОВ ЦИАНОПРОКАРИОТ В ПЛАНКТОНЕ НИЖНЕГО ДОНА МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2006 г. академик Г.Г. Матшиов12, член-корреспондент РАН Д.Г. Матшпов1*2, Т.В. Фуштен2, М.И. Руднев1, В.Г. Сойер1, Д.В. Зимаков1
В пробах планктона из нижнего течения р. Дон впервые идентифицированы токсины циано-прокариот микроцистин-RR и анатоксин-я. Определение токсинов проведено методом тандемной масс-спектроскопии с применением МО-спектрометра "Thermo Finnigan LCQ Deca XP MAX" с ионизацией электроспреем при положительной полярности. Изложены методики отбора альго-логических проб и последующей обработки материала. Обоснована возможность и необходимость мониторинга токсинов цианопрокариот в природных водах равнинной части Северного Кавказа.
В последние десятилетия во внутренних водоемах многих стран участились случаи вредоносных цветений микроводорослей, вызывающих гибель водных организмов, заболевания сельскохозяйственных животных и людей. Установлено, что причиной ущерба служили токсины цианопрокариот (СуапорЬу1а) [1-3].
Токсины цианопрокариот были обнаружены не только при массовом развитии вредоносных видов, но и при невысокой плотности их популяции. В ряде работ данный эффект объяснен свойствами вегетирующего штамма [4-6]. В то же время отмечено, что не все штаммы токсичных видов вредоносны, а количество продуцируемых ими токсинов зависит от множества факторов: трофности водоема, физиологического состояния популяции цианопрокариот, сезона.
По рекомендациям Всемирной организации здравоохранения [7], содержание токсинов цианопрокариот, в том числе микроцистина-ВД1 и анатоксина-я, в питьевой воде и рекреационных водоемах не должно достигать концентраций, угрожающих здоровью и жизни человека, и поэтому подлежит мониторингу. Установлено [7], что даже низкие концентрации гепатотоксичных ми-кроцистинов могут быть причиной рака печени.
В Российской Федерации контроль токсинов законодательно не предусмотрен, поэтому исследование цианопрокариот с целью определения их токсичности проводится только в научных целях
1 Южный научный центр Российской академии наук, Ростов-на-Дону.
2 Азовский филиал Мурманского морского биологического института Кольского научного центра Российской академии наук, Ростов-на-Дону.
на водоемах Северо-Запада России [8-10]. Тот факт, что вредоносные "цветения воды" наблюдали в регионе, расположенном на краю ареала теплолюбивых таксонов, указывает на актуальность проблемы в России в целом. Для Ростовской области проблема еще более важна, поскольку цианопрокариоты являются естественным компонентом экосистемы равнинных водоемов [11, 12], группой, доминирующей на протяжении всего летнего сезона. Их появление не связано напрямую с антропогенной эвтрофикацией.
В 2005 г. в Южном научном центре РАН начаты исследования токсичности планктона, обусловленной цианопрокариотами. В протоке Свиное Гирло на территории биостанции Южного научного центра РАН в пос. Кагальник Азовского района Ростовской области 16 октября 2005 г. была отобрана батометрическая проба и произведен лов планктона сетью Апштейна. Отбор выполнили при сильном северо-западном ветре во время дождя, при температуре воды в реке +8 °С. Вода имела оливково-бурую окраску, обусловленную сезонной вспышкой развития ди-нофлагеллаты Peridiniopsis penardi (Lemmermann) Bourrelly.
Подсчет клеток в световом микроскопе в камере Ножжотта под увеличением 200 х показал, что плотность популяции этого вида достигала 8,4 млн кл./л. Сопутствующими видами были Isoselmis simplex Butcher и Plagioselmis punctata Butcher (Cryptophyta), численность которых составляла 3,8 и 4,2 млн кл./л соответственно. Обильны были также Pyramimonas semiglobosa Pascher (Prasinophyta), Monoraphium contortum (Korschikoff) Hindäk (Chlorophyta), Cryptomonas
erosa Ehrenberg, emend, von Stein (Cryptophyta). Цианопрокариоты в сообществе не были обнаружены. Однако это не означает отсутствия представителей отдела в водоеме. Сетной планктон на 100% был сформирован двумя видами циано-прокариот. Преобладал Microcystis flos-aquae (Wittrock in Wittrock & Nordstedt) Kirchner, численность которого достигала 88 млн кл/л. Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs ex Bomet et Flahault был относительно редок: 3-4 тыс. трихомов в литре при средней длине трихома 250 мкм. Оба вида для региональной флоры обычны, максимум их развития в р. Дон и Таганрогском заливе приходится на конец лета и начало осени.
Вторая проба представляла собой высохшую бирюзово-зеленую пленку цианопрокариот на соломине Phragmites communis L. Материал был собран на левом берегу р. Дон на перекате Донецкий, в 4 км выше пос. Колузаево. Планктон осел на побегах тростника в результате ветрового сгона за четыре дня до отбора материала. Для определения видов и химического анализа с фрагмента соломины длиной 5 см был взят со-скоб пленки планктона. Воздушно-сухая масса материала составляла 11,8 мг. Материал был просмотрен в световом микроскопе в водных препаратах под увеличением 400 х. В пробе присутствовали деформированные клетки Microcystis sp. Колонии и трихомы цианопрокариот были разрушены, идентификация видов не представлялась возможной.
Фильтрование клеток и экстрагирование токсинов цианопрокариот проведены на основе методики, обеспечивающей степень извлечения ми-кроцистина более 99% и минимальный уровень обнаружения микроцистина 0,01 мкг/л [13].
Пробу цианопрокариот, отобранную сетью в протоке Свиное Гирло, объемом 100 мл фильтровали через стекловолоконный фильтр GMF 5 удельной плотностью 75 г/м2 и диаметром 47 мм. Полученный на фильтре прерывистый слой клеток микроводорослей замораживали при -18 °С в течение суток. Для извлечения токсинов из клеток фильтр пятикратно перемораживали по схеме (20 мин при -18 °С <-» 10 мин при +20 °С), затем помещали в 5 мл метанола. Экстракт, полученный из слоя клеток после обработки ультразвуком в бане с ледяной водой в течение 60 мин, упаривали при температуре +20 °С в токе аргона насухо. Остаток растворяли в 0,40 мл метанола с добавкой 0,1% трифторуксусной кислоты и центрифугировали при 4000 оборотах в минуту (~ 3000 g) в течение 6 мин с последующим переносом супернатанта в хроматографи-ческую виалу.
Токсины цианопрокариот определяли методом тандемной масс-спектроскопии с применением МО-спектрометра "Thermo Finnigan LCQ Deca XP MAX" с ионизацией электроспреем при положительной полярности*. Применен прямой ввод экстракта пробы со скоростью 5 мкл/мин. Напряжение на конусе оптимизировали для каждого соединения. Спектры МС/МС и МС/МС/МС получали с применением ионной ловушки и нормализованной энергии столкновений, обеспечивающей воспроизводимость результатов для различных приборов. Во время каждого МСп-экспери-мента величины заряда ионов определяли с использованием функции ZoomScan.
Согласно методикам идентификации токсинов [14-16], в которых использовали эталонные образцы токсинов цианопрокариот, для анатокси-на-а идентификационным признаком является молекулярный монопротонированный катион [М + Н]+ с miz 166,2; для микроцистина-RR в качестве идентификационного признака"* выбран двухзарядный молекулярный катион [М + 2Н]+2 с m/z 520. При отнесении масс-спектров исключены ионы ассоциатов метанола с добавкой 0,1%-ной трифторуксусной кислоты.
В результате исследования двух проб по выбранным идентификационным признакам микро-цистина-RR и анатоксин а-я установлено: проба цианопрокариот, полученная с тростниковой соломины, содержит анатоксин-a в концентрации не менее 1,67 мкг/г сухой массы пленки (рис. 1А); проба цианопрокариот, отобранная сетью в протоке Свиное Гирло, содержит микроцистин-RR и анатоксин-a в количестве не менее 2,2 • КГ2 пкг на клетку (рис. 1Б) и 5 ■ 10"2 пкг на трихом соответственно***. Определение точного количества токсинов в каждой пробе микроводорослей требует применения стандартов токсинов, отсутствующих в начале исследований, поэтому строгий количественный анализ содержания токсинов в пробах не проводили. Однако микр оцистин-RR, обнаруженный в сетной пробе, имеет концентра-
* Использованы термины, рекомендованные Всероссийским масс-спектрометр ическим обществом [17].
** Среди наиболее распространенных циклоолигопеп-тидных токсинов цианопрокариот (нодуларин, микроцисти-ны -ЬЯ, -УЛ и -М?.) только микроцистин-КЯ содержит два остатка аргинина с легко про тонируемыми фрагментами гуанидина, что для молекулярных ионов токсинов обусловливает заряд (г = 2 для микроцистина-ОД и г = 1 для остальных циклоолигопептидов).
*** Схемы ионизации молекул каждого соединения, полученные при использовании возможностей тандемного МЭ" масс-спектрометра, согласуются с молекулярными структурами микроцистина-ЯЯ и анатоксина-а, подтверждая обнаружение токсинов в пробах.
ОБНАРУЖЕНИЕ ТОКСИНОВ ЦИАНОПРОКАРИОТ
77
g 40
1
120,27
148,87
h i ii 1111 í i rf*t 11 ffrrii"|HM|"vf rt 11 ц 11 Д 11111111 и fu n |
166,20
80
120
160
200
100 q
g 30
320 360 400 440 480 520
Рнс. 1. Масс-спектр анатоксина-а (А) и микроцистина-RR (Б), полученные Meto дом ВЭЖХ/МС в режиме электроспрея для положительных ионов с miz =166 (А) при напряжении 30 В и m/г = 520 (Б) при напряжении 35 В соответственно.
цию порядка > 10-2 пкг на одну клетку, что практически совпадает с концентрацией 0,2 пкг/кл. для родственного микроцистина-ЬЯ. Для рекреационных вод такая концентрация признана опасной для здоровья [7].
Таким образом, использованное при проведении работ аналитическое оборудование и методики подготовки проб позволяют обнаруживать
и идентифицировать токсины, продуцируемые цианопрокариотами. В водах Нижнего Дона в период спада активности микроводорослей идентифицированы анатоксин-а и микроцистин-КИ ориентировочно в опасной для здоровья концентрации (на уровне более 0,01 мкг/л). Эта концентрация обычна для районов, где наблюдаются токсические "цветения воды". В природных условиях
воздушно-сухая пленка отмерших цианопрокари-от сохраняет анатоксин-a в течение нескольких суток. Высокая токсичность этих веществ, тривиальность продуци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.