научная статья по теме ОБНАРУЖЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ У ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ Математика

Текст научной статьи на тему «ОБНАРУЖЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ У ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 425, № 2, с. 280-282

^ ОБЩАЯ ^^^^^^^^^^^^

БИОЛОГИЯ

УДК 581.111.2:581.543.4

ОБНАРУЖЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ У ВОЗБУДИТЕЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ

© 2009 г. Т. Н. Шафикова, Е. Ю. Эпова, А. С. Романенко, член-корреспондент РАН Р. К. Саляев

Поступило 31.07.2008 г.

Кольцевая гниль картофеля, системное заболевание, вызываемое грамположительной бактерией Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms), является одним из наиболее распространенных и вредоносных бактериозов. Типичными симптомами болезни являются увядание надземной части растения и кольцевая гниль клубней, в результате чего потери урожая картофеля в отдельные годы могут составлять до 50% [4, 9]. Заболевание встречается на 5 континентах более чем в 30 странах мира [10]. Возбудитель заболевания представляет объект международного карантинного контроля и включен в список А2 Европейской организации по защите растений. В настоящее время отмечается тенденция к прогрессивному распространению данного бактериоза, в том числе и на территории Российской Федерации. Несмотря на это, механизмы патогенеза кольцевой гнили исследованы недостаточно. Проблема осложняется еще и тем, что для Cms характерны латентные (скрытые) стадии болезни, в течение которых зараженные растения не имеют выраженных симптомов, а инфицированные клубни визуально не отличаются от здоровых.

Фитопатогенные микроорганизмы после первичного контакта с растением секретируют гидролазы, разрушающие полимеры растительной клеточной стенки. Наряду с целлюлазами, поли-галактуроназами, пектатлиазами и ксиланазами многие бактериальные патогены растений продуцируют активные экстрацеллюлярные протеина-зы [11, 12]. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что внеклеточные протеиназы играют важную роль в патогенезе. Так, клонирование гена C. michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), возбудителя рака томатов, кодирующего экстрацеллюлярную протеиназу, частично вос-

Сибирский институт физиологии и биохимии растений

Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск

станавливало вирулентность непатогенного штамма Cmm [6]. Очищенная экстрацеллюлярная металлопротеиназа другой фитопатогенной бактерии, Erwinia carotovora subsp. carotovora, расщепляла лектин картофеля, принимающий участие в защите растений [3].

Из литературы известно, что возбудитель кольцевой гнили картофеля секретирует экзо-ферменты - амилазу, целлюлазу, которые, как считают авторы, являются факторами патогенно-сти бактерий [7]. Логично было предположить, что среди внеклеточных ферментов, определяющих патогенность Cms, присутствуют также и протеиназы. Поэтому цель настоящей работы - выявление внеклеточных протеиназ возбудителя кольцевой гнили картофеля и исследование свойств этих ферментов.

В результате проведенных исследований впервые было установлено, что в составе экзофер-ментов Cms действительно присутствуют протео-литические ферменты, которые специфичны к субстратам трипсина и субтилизина и относятся к классу сериновых протеиназ.

Штамм CsR 5 бактерий C. michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kott., Skaptason et Burkh) любезно предоставленный M. Metzler (Turku, Финляндия), выращивали в колбах в темноте при температуре 26°C на жидкой питательной среде C следующего состава: пептон - 10 г/л, диализат дрожжевого экстракта ("Sigma", США) - 5 г/л, глюкоза - 5 г/л, хлорид натрия ("Реахим", Россия) - 5 г/л (рН 7.2) [8]. Для выявления внеклеточной протеолитической активности микробиологическим методом бактерии вносили в обезжиренное молоко, стерилизованное при давлении 0.5 атм в течение 20 мин. Активность протеиназ в препарате белков культуральной жидкости Cms, осажденных (NH4)2SO4 (до 80% насыщения), определяли спектрофотометрически при длине волны 750 нм, используя в качестве субстрата казеин ("Реахим", Россия). Время гидролиза - 60 мин [1]. Ами-дазную активность фермента определяли методом Эрлангера с соавторами [5], используя синтетические субстраты, и-нитроанилиды: карбобензокси-L-глицил-£-глицил-£-лейцин ^^у^у^^е^^А),

ОБНАРУЖЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ

281

OD, опт. ед 0.04

0.02

10 11 11.9 pH

Рис. 1. Зависимость общей протеиназной активности белков культуральной жидкости Cms от величины рН (штамм CsR5).

Kap6o6eH30KCH-L-anaHHn-L-anaHHn-L-nponHH (Z-Ala-Ala-Pro-pNA), N-a-6eH3onn-DL-aprHHHH (Ben-zoyl-DL-Arg-pNA), кapбoбeнзoкcи-L-фeнилaлa-нин (Z-Phe-pNA), кapбoбeнзoкcи-L-глyтaмин (Z-Glu-pNA), кapбoбeнзoкcи-L-aлaнил-L-aлaнил-L-aлaнин (Z-Ala-Ala-Ala-pNA) ("Serva", Гepмaния). Aмидaзнyю aктивнocть oпpeдeляли пpи длинe вoлны 410 нм.

Пpи изyчeнии дeйcтвия cинтeтичecкиx ингиби-TopoB Ha aктивнocть внeклeтoчныx пpoтeинaз Cms пpeпapaт бeлкoв кyльтypaльнoй жидкocти ин-кyбиpoвaли c paCTBopoM ингибитopa пpи кoмнaтнoй тeмпepaтype в тeчeниe 30 мин, пocлe 4ero oпpeдeля-ли ocтaтoчнyю пpoтeoлитичecкyю aктивнocть, кaк yкaзaнo вышe. В paбoтe иcпoльзoвaли 1 мМ фeнил-мeтилcyльфoнилфтopид (ФМСФ), 1 мМ дитиoтpeи-тoл (ДТТ) ("Serva" , Гepмaния), 1 мМ HgCl2 ("Pea-хим", Poccия). Сoдepжaниe бeлкa oпpeдeляли пo мe-тoдy Бpeдфopд, иcпoльзyя в кaчecтвe cтaндapтa ECA ("Sigma", CffiA) [2].

Выявлeниe ceкpeтиpyeмыx пpoтeинaз y вoзбy-дитeля кoльцeвoй гнили кapтoфeля пpoвoдили микpoбиoлoгичecким мeтoдoм; пpoтeoлитичe-c^fl aктивнocть пpoявлялacь чepeз 12 cyт кaк o6-paзoвaниe cгycткa и зoны пeптoнизaции - мoлoкo cтaнoвилocь пpoзpaчным (дaнныe He пpeдcтaвлe-ны). Зaтeм нaличиe aктивнocти пpoтeинaз в cpeдe кyльтивиpoвaния Cms пoдтвepдили биoxимичecки -мeтoдoм AHcoHa [1]. Aктивнocть фepмeнтa pera-cтpиpoвaлacь в диaпaзoнe знaчeний pH oт 6 дo 10. Peзyльтaты зaвиcимocти пpoтeoлитичecкoй a^ тивнocти бeлкoв кyльтypaльнoй жидкocти Cms oт pH cpeды пpивeдeны Ha pTO. 1. Haибoлee выcoкий ypoBern aктивнocти пpoявлялcя в cлaбoщeлoчнoй oблacти pH c мaкcимyмoм в диaпaзoнe знaчeний pH 7.6-8.5. В щeлoчнoй oблacти pH oбнapyжи-лacь oблacть кpивoй, yкaзывaющaя Ha тo, что, вoзмoжнo, cpeди пpoтeинaз Cms пpиcyтcтвyют изoфepмeнты c oптимyмoм дeйcтвия пpи pH 10.

Для oпpeдeлeния cyбcтpaтнoй cпeцифичнocти aктивнocти фepмeнтoв, ceкpeтиpyeмыx Cms, то-пoльзoвaли cинтeтичecкиe n-нитpoaнилиды N^a-

OD, om\ eд.

0.4 -

0.3 -

0.2 -

0.1 -

0 i

1

2

3

4

5

6

Рис. 2. Cye^'pa^an cпeцифичнocть внeклeтoчныx пpoтeинaз C. michiganensis subsp. sepedonicus (штaмм CsR5). Cинтeтичecкиe cye^'parai пpoтeинaз paзлич-ных клaccoв: (1) Z-Ala-Ala-Pro-pNA - cyбcтpaт npo-лилэндoпeптидaзы; (2) Z-Gly-Gly-L-Leu-pNA -cyбcтpaт cyбтилизинa; (3) Benzoyl-DL-Arg-pNA - cy6-cтpaт тpипcинa; (4) Z-Phe-pNA - cyбcтpaт aминoпeп-тидaзы; (5) Z-Glu-pNA - cyбcтpaт глyтaмилэндoпeп-тидaзы; (6) Z-Ala-Ala-Ala-pNA - cyбcтpaт элacтaзы.

мещенных аминокислот и трипептидов, являющихся субстратами протеиназ различных классов (рис. 2). Оказалось, что протеиназы наиболее эффективно гидролизовали Z-Gly-Gly-L-Lcu-pNA (субстрат субтилизиноподобных ферментов) и Ben-zoyl-DL-Arg-^NA (субстрат трипсиноподобных ферментов). В то же время они не действовали на субстраты глутамилэндопептидазы (Z-Glu-pNA), пролилэндопептидазы ^-А1а-А1а-Рго-^А), а также аминопептидаз (Z-Рhе-pNA) и эластазы (Z-A1а-A1а-A1а-pNA). Таким образом, протео-литическая активность ферментов культуральной жидкости Cms отмечалась в случае субстратов трипсина и субтилизина. На основании этого можно предполагать наличие у возбудителя Cms внеклеточных протеиназ, принадлежащих к классу сериновых.

Для подтверждения данного предположения был проведен ингибиторный анализ (рис. 3). Ингибитор сериновых протеиназ ФМСФ значительно (на 72%) снижал пептидазную активность субти-лизинового типа и на 70% ингибировал активность по субстрату трипсина. Дитиотреитол (ДТТ, активатор цистеиновых протеиназ) незначительно (на 10.5%) снижал активность по субстрату субтилизина и по субстрату трипсина (на 7.5%). Как видно из представленных данных, HgC12 подавлял активность протеиназ как по субстрату субтилизина, так и по субстрату трипсина, что согласуется с данными о том, что под действием солей тяжелых металлов активность многих сериновых протеиназ снижается [13]. Таким образом, результаты инги-биторного анализа подтверждают принадлежность протеиназ к классу сериновых.

Полученные данные свидетельствуют о том, что возбудитель кольцевой гнили картофеля сек-ретирует протеолитические ферменты, максимальная активность которых лежит в диапазоне

0

ÑOKnAÑbl AKAÑEMHH HAYK том 425 < 2 2009

282

ШАФИКОВА и др.

Активность фермента, % к контр.

3

Рис. 3. Влияние ингибиторов на активность внеклеточных протеиназ C. michiganensis subsp. sepedonicus (штамм CsR5); а - 7-01у-01у-Ь-Ьеи-^КА - субстрат субтилизина, б - Benzoyl-DL-Arg-^NA - субстрат трипсина. Ингибиторы протеиназ различных классов: 1 - ФМСФ; 2 - ДТТ; 3 - HgC12.

значений рН 7.6-8.5. Установлено, что внеклеточные протеиназы обладают специфичностью к субстратам субтилизина и трипсина и относятся к классу сериновых протеиназ. Не исключено, что обнаруженные нами экзопротеиназы принимают участие в развитии патогенеза кольцевой гнили картофеля и являются факторами патогенности бактерий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Anson M.L. // J. Gen. Physiol. 1938. V. 22. P. 79-89.

2. Bradford M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

3. Dow J.M, Davies H.A., Daniels M.J. // Mol. Plant-Microbe Int. 1998. V. 11. P. 1085-1093.

4. Easton G.D. // Amer. Potato J. 1979. V. 56. P. 459-460.

5. Erlanger B.F., Kokowsky N, Cohen W. // Arch. Biochem. and Biophys. 1961. V. 95. № 2. P. 271-278.

6. Gartemann K.-H, Kirchner О., Engemann J. et al. // J. Biotechnol. 2003. V. 106. P. 179-191.

7. Metzler M.C, Laine M.J, Boer S.H. // FEBS Microbiol. Lett. 1997. V. 150. № 1. P. 1-8.

8. Meletzus D, EichenlaubR. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. № 1. P. 184-190.

9. Muller H J, Ficke W. // Nachrichtenbl. Pflanzenschutz DDR. 1974. Bd. 28. S. 159-160.

10. Stead D.E., Wilson J. A Review of the Risks and Yield Losses Caused by the Potato Ring Rot Pathogen, Clavi-bacter michiganensis subsp. sepedonicus. Internal Report CSL. Harpenden, 1996. P. 9.

11. Xia У. // Cell. Microbiol. 2004. V. 6. № 10. P. 905-913.

12. Валуева T.A., Мосолов B.B. //

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком