МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 980-984
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 576.316:577.1
ОБНАРУЖЕНИЕ ВНУТРИГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКА LR2 МЕЖГЕННОГО РИБОСОМНОГО СПЕЙСЕРА ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. Д. В. Шибалев, А. С. Воронов, С. Ю. Фирсов, А. П. Рысков, Н. С. Куприянова*
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334 Поступила в редакцию 17.02.2004 г.
Индивидуальная и внутривидовая гомогенность повторяющихся единиц рДНК, как принято считать, поддерживается с помощью согласованной эволюции, обеспечиваемой механизмами неравного кроссинговера и генной конверсии. Однако эти механизмы могут приводить к прямо противоположным результатам - к коррекции или элиминированию новых вариантов генов, или к распространению новых вариантов по индивидуальным кластерам гомологичных и негомологичных хромосом. Нами клонированы и частично секвенированы 36 копий участка межгенного рибосомно-го спейсера человека с координатами 22763-23523, считая от стартовой точки транскрипции, полученных путем ПЦР-амплификации из генома одного индивида. Этот участок, обогащенный поли (G) и (AG)n-кластерами, входит в состав элемента LR2 длиной 2 т.п.н. межгенного рибосомного спейсера. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что среди 36 рекомбинант-ных вставок нет ни одной идентичной пары, а 26 клонов отличаются лишь по числу повторяющихся элементов в паралогичных (G)n и (AG^-кластерах. Остальные 10 клонов отличались не только числом повторяющихся элементов в кластерах, но и содержали инсерции или делеции разной длины, которые не соответствуют ранее охарактеризованным полиморфным вариантам межгенного рибосомного спейсера человека.
Ключевые слова: геном человека, рибосомный межгенный спейсер, ПЦР-амплификация, полиморфизм ДНК, микросателлиты, мутации.
DETECTION OF INTRAGENOMIC POLYMORPHISM IN THE LR2 REGION OF HUMAN INTER-GENIK RIBOSOMAL SPACER, by D. V. Shibalev, A. S. Voronov, S. Yu. Firsov, A. P. Ryskov, N. S. Kupri-yanova* (Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia, E-mail: cu-prum@atrus.ru). It is a common point of view today that tandem ribosomal genes are subject to concerted evolution, a process that promotes homogeneity among the many copies through the mechanisms of unequal homologous exchange and gene conversion. These mechanisms can lead to opposite results: they can correct and eliminate new variants and they also can promote the spread of new gene variants throughout individual gene clusters among homologous and non homologous chromosomes. A number of experiments performed to decide which of these mechanisms is more important have yielded contradictory answers to this question. In this work we have cloned and partially sequenced 36 PCR-amplified copies of the human rIGS segment 22763-23523 apart from the transcription start point, obtained from the individual genome. This segment is enriched by (G)n and (AG)n clusters and enters into 2kb LR2 element of the human rIGS. Comparative analysis showed that absolutely identical sequences are absent among 36 inserts sequenced. The 26 clones differed only on a number of repeating elements in the paralogous (G)n and (AG)n clusters. The last ten clones differed not only on a number of cluster repeating elements, but contained insertions and deletions of distinct sizes, which do not correspond to the human rIGS polymorphism variants described earlier.
Рибосомная ДНК (рДНК) образована множеством высококонсервативных тандемных повторов, в состав которых входят участки, кодирующие рРНК и нетранскрибируемые межгенные спейсе-ры (рМГС). Транскрибируемые области также содержат внешние и внутренние спейсерные участки (5'ВшТС, ВТС-1, ВТС-2 и 3'ВшТС). Считается, что индивидуальная и внутривидовая гомоген-
Принятые сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, - додецилсульфат натрия, 88С - стандартный цитрат натрия, ЕБТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.
*Эл. почта: cuprum@atrus.ru
ность повторяющихся единиц рДНК поддерживается с помощью согласованной эволюции, обеспечиваемой механизмами неравного кроссинговера и генной конверсии. Впервые такое предположение было высказано более 20 лет назад [1]. Однако указанные механизмы могут приводить к прямо противоположным результатам - как к коррекции или элиминированию новых вариантов генов, так и к распространению новых вариантов по индивидуальным кластерам гомологичных и негомологичных хромосом. Опыты, проводимые для определения того, какой из механизмов наи-
более активно действует в процессе согласованной эволюции на различных участках рДНК, часто давали противоречивые результаты. Так присутствие одинаковых по размеру рМГС на негомологичных хромосомах [2—4] и возрастание числа вариабельных по длине копий рМГС в последующих поколениях [5, 6] свидетельствует в пользу рекомбинаций между негомологичными хромосомами. С другой стороны, получены данные, указывающие на существование внутрихромосомного обмена в рМГС, например, семейное наследование вариантов спейсе-ров по Менделю, синтения в наследовании вариантов рМГС [6, 7], разбалансировка клеточных линий по рДНК человека [8] и т.д. При изучении нуклеотидных последовательностей рМГС и ВТС одной и той же особи дрозофилы оказалось, что кластеры рДНК на X и У хромосомах содержат одинаковые варианты рМГС, тогда как варианты ВТС в тех же кластерах хромосомоспецифичны [9]. Определенный уровень внутригеномных вариаций обнаружен в ВТС-1 и ВТС-2 пресноводного рака [10]. Такой тип разнообразия наиболее вероятен в партеногенетических линиях, где согласованной эволюции может препятствовать отсутствие рекомбинаций [11-13]. При рестрикционно-гибридизаци-онном анализе повторов рДНК, клонированных в составе космидной клонотеки хромосомы 13 человека, стандартные характеристики получены лишь для части мономеров. Значительная же часть клонов рДНК содержала большое число нуклеотидных замен, дополнительные микроса-теллитные кластеры и делеции различной протяженности [14, 15]. Сравнение нуклеотидных последовательностей индивидуальных (хромосомо-специфичных) тандемов рДНК, полученных из соматических клеточных гибридов грызун-человек, позволило предположить, что кодирующая и регуляторная области подвергаются частой внутри- и межхромосомной гомогенизации, тогда как участки рМГС гомогенизируются преимущественно локально. В результате в пределах одной хромосомы появляются субкластеры рМГС, отличающиеся по нуклеотидной последовательности [16].
В настоящей работе клонированы и частично секвенированы 36 копий участка рМГС (2276323523), полученных путем ПЦР-амплификации из генома одного индивида. Этот участок, обогащенный поли (в)- и (Ав)п-кластерами, входит в состав элемента 2 т.п.н. ЬЙ2 рМГС человека [17]. Сравнительный анализ показал, что среди 36 нуклеотидных последовательностей нет ни одной абсолютно идентичной пары. Некоторые из них отличались по числу повторяющихся элементов в паралогичных вп- и (Ав)п-кластерах, другие содержали как единичные нуклеотидные замены, так и инсерции или делеции различной длины, которые не соответствуют ранее изученным полиморфным вариантам рМГС человека.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Суммарную ДНК лейкоцитов выделяли из цельной крови по методу Мэтью [18]. Концентрацию и целостность ДНК оценивали спектрофото-метрически и с помощью электрофореза в 0.8%-ном агарозном геле. ПЦР-амплификацию проводили на автоматическом термоциклере Терцик с использованием праймеров П1 (5'-ttctgtcagtctgtca-gacac-3') и П2 (5'-gaaacccccctgactcaggtcaag-3') c координатами 22763-22786 и 23523-23500 соответственно [17]. Реакционная смесь содержала в 30 мкл 100 нг матричной ДНК, 10 пМ каждого праймера, 250 мкМ каждого dNTP в 67 мМ Трис-НС1-буфере рН 8.8, 16 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20, 2.5 мМ MgCl2, 1.0 ед. ДНК-полимеразы Ther-mus aquaticus ("Fermentas", Литва). Использовали следующий температурный режим: первый цикл -95°С, 1 мин, 57°С, 1 мин, 74°С, 2 мин; 34 цикла -95°С, 40 с, 57°С, 40 с, 74°С, 1 мин; последний цикл -95°С, 40 с, 57°С, 40 с, 74°С, 3 мин. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле и визуализировали, окрашивая бромистым этидием. ПЦР-продукты клонировали в вектор pGEM-T Easy ("Promega", США) по методике фирмы производителя. Клоны отбирали посредством гибридизации с колониями, используя маркерный олигонуклеотид П3 (5'-tactgtcggacacagcactga-3') с координатами 23253-23 273 [17], меченный по 5'-концу [у-32Р]АТР с помощью полинуклеотидкина-зы ("Amersham", США). Предгибридизация и гибридизация выполнены при 45°С в х5 SSC, х5 растворе Денхардта, 1% SDS и 1 мМ EDTA. Фильтры отмывали при комнатной температуре в х 2 SSC, 0.2% SDS. Секвенирование проводили с использованием набора "fmol DNA Seq.System" ("Promega", США) (праймер П3) согласно протоколу фирмы производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлена схема строения мономера рДНК человека. В его составе выделены повторы ЬЯ с координатами 20569—22625 (ЬЯ1) и 23035-25043 (ЬЯ2), которые имеют длину около 2 т.п.н. и содержат по два А/и-элемента. Иногда число ЬЯ-повторов в рМГС человека может равняться трем [17]. Характерными типами полиморфизма рДНК человека являются вариации длины и числа тандемных повторов в рМГС и точковые мутации в транскрибируемых областях [14, 15, 17-21]. Недавно при сравнении между собой рДНК человека, входящих в состав разных монохромосомных гибридов, в ЬЯ1 обнаружили вариабельный участок [16].
Мы изучали внутригеномный полиморфизм участка ЬЯ2. В результате амплификации геномной ДНК одного индивида с праймерами 2276422786 и 23523-23500 (район ЬЯ2) синтезировали
П2
Рис. 1. Схема повтора рДНК человека. Участок ЬЯ2 представлен в увеличенном масштабе. Точка начала транскрипции обозначена изогнутой стрелкой и буквой t. П1 и П2 - олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПЦР-амплификации ДНК; П3 - олигонуклеотидный праймер, использованный для секвенирования. Жирным выделены А/и-повторы.
0 GAGAGAGAGAGAGAGACGGGGAGAGAGGGGGGAGA (G)9 (AG
1 GAGAGAGAGAGAGAGACGGGGAGAGAGGGGGGAGA (G)7 (AG
2 GAGAGAGAGAGAGAGACGGGGAGAGAGGGGGGAGA (G)9
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.