ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 87, № 12, с. 2070-2073
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ РАСТВОРОВ
УДК 544.35:[544.17+544.18]
ОБРАЗОВАНИЕ АССОЦИАТОВ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА С ТЕТРА(4,4'-КАРБОКСИ)ФЕНИЛАМИНО-И ТЕТРА(4,4'-КАРБОКСИ)ФЕНИЛОКСИ- ФТАЛОЦИАНИНАМИ ЦИНКА В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ ПРИ 298 К © 2013 г. Н. Ш. Лебедева, Т. Е. Попова, Е. А. Малькова, Ю. А. Губарев
Российская академия наук, Институт химии растворов, Иваново E-mail: gua@isc-ras.ru Поступила в редакцию 04.02.2013 г.
Проведены исследования состояния водорастворимых цинковых комплексов фталоцианинов, содержащих —O—C6H4—COONa и —NH—C6H4—COONa заместители в водных и водно-органических средах. Для каждого фталоцианина установлен тип димеризации. С учетом ассоциативных равновесий фталоцианинов изучены процессы их взаимодействия с бычьим сывороточным альбумином. Показано, что фталоцианины локализованы в субдоменах IB и IIA протеина, а взаимодействие между белком и фталоцианинами является многоцентровым.
Ключевые слова: тетра-4-[(4'-карбокси)фенилсульфо]фталоцианин цинка, тетра-4-[(4'-карбок-си)фенилсульфо]фталоцианин цинка, бычий сывороточный альбумин.
DOI: 10.7868/S0044453713120157
Гидрофобные эффекты играют важную роль в биохимических системах и являются одним из основных факторов, контролирующих конформацию природных макромолекул и определяющих их ком-плексообразующую способность [1, 2]. В частности транспортная функция альбуминов существенно зависит от гидрофобно/липофильного характера лигандов. Липофильные макрогетероциклические соединения фталоцианинового класса (МГС) являются перспективными фотосенсибилизаторами для диагностики и лечения различных заболеваний [3]. Широкие возможности модификации фталоциа-ниновых молекул позволяют получить соединения различной степени липофильности. При этом пе-
риферийные заместители фталоцианиновых молекул могут содержать гетероатомы, способствующие стереоселективности или комплементарности связывания с транспортными протеинами [4]. В связи с вышеизложенным, целью данной работы являлось исследование взаимодействия бычьего сывороточного альбумина (БСА) с липофильными фта-лоцианинами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Фталоцианины (структурная формула представлена ниже) синтезированы и очищены по стандартным методикам [5].
X = O-ZnPc(4-O—C6H4—COONa)4 X = NH-ZnPc(4-NH-C6H4-COONa)4
ОБРАЗОВАНИЕ АССОЦИАТОВ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА
2071
800
X, нм
500
600
700
800 X, нм
Рис. 1. ЭСП ZnPc(4-O—C6H4—COONa)4 (2 х 10-5 М): 1 — в ДМФА, 2 — в боратном буфере.
Альбумин бычий сывороточный, фракция V, pH 7.0 "Acros Organics" использовался без дополнительной очистки; ДМФА был очищен по стандартной методике [6].
Боратный буфер (pH 8.6) готовили согласно рекомендациям [7] из тетрабората натрия (Na2B4O7 • 10H2O) "Химмед", очищенного двойной перекристаллизацией из водного раствора и раствора 0.1н HCl, приготовленного с использованием стандарт-титра "Уралхиминвест". Водно-органический растворитель готовили добавлением ДМФА в боратный буфер в концентрации 0.19 М.
Спектры флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра Unico 2800.
Кинематические вязкости водных растворов определяли на капиллярном вискозиметре, сбор и анализ данных осуществлялся с помощью ПК. Кинематическая вязкость воды при 298.15 К составила 0.8942 мПа с, что согласуется с литературными данными [8].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изучение взаимодействия БСА с МГС представляет собой сложную экспериментальную задачу, что связано с ограниченной растворимостью липофильных соединений в воде и денатурацией белка в среде органических растворителей. Переход из органических сред к водным растворам МГС приводит к их самоассоциации, что проявляется в гипсохромном смещении максимума поглощения, уменьшении интенсивности и уширении спектральной полосы (рис. 1). В связи с необходимостью учитывать ассоциативные равновесия, на первом этапе работы был исследо-
Рис. 2. ЭСП ZnPc(4-O—C6H4—COONa)4 в водном растворе при титровании ДМФА.
ван характер образующихся ассоциатов. Рассмотрим экспериментальные данные, полученные для 2пРс(4-0—С6Н4—С00№)4. Увеличение температуры раствора, титрование диметилсульфокси-дом, увеличение ионной силы (добавление №С1) смещают ассоциативное равновесие в сторону ассоциации. Напротив, добавление комплексооб-разующих агентов, способных аксиально координироваться на ионе цинка фталоцианина (пиридин, ДМФА) или способных к Н-связыванию с периферийными карбоксильными группами (этанол) приводят к смещению ассоциативного равновесия в сторону мономеризации (рис. 2). Перечисленные спектральные изменения характерны для п—п-димеризации фталоцианинов.
Известно, что устойчивость п—п-димеров определяется эффективностью п—а-связывания между соседними фталоцианиновыми молекулами и п—п-отталкиванием между одноименно заряженными периферийными заместителями соседних фталоцианиновых молекул. Увеличение температуры уменьшает диэлектрическая проницаемость водных растворов, что приводит к уменьшению степени ионизации периферийных заместителей, уменьшение электростатического отталкивания между карбоксильными группами соседних молекул фталоцианинов и способствует ассоциации МГС.
Вероятно, аналогичный механизм, связанный с уменьшением диэлектрической проницаемости, имеет место при добавлении диметилсуль-фоксида, так же способствующего самоассоциации МГС. Присоединение лигандов, способных к аксиальной координации (пиридин, ДМФА), а так же сольватация периферийных заместителей молекулами этанола стерически препятствует копланар-ному расположению молекул в составе п—п-димеров. 2пРс(4-О—С6Н4—С0О№)4 в растворах ДМФА существует в мономерной форме и интенсивно флуоресцирует (к = 697 нм), в водных средах происходит полное тушение флуоресценции, что подтверждает образование п—п-димеров.
2072
ЛЕБЕДЕВА и др.
Рис. 3. Схема J-агрегатов.
Рассмотрим экспериментальные данные, полученные для 2пРе(4-МИ-С6И4-СООМа)4. Увеличение температуры, добавление ДМФА и поверхностно активных веществ не приводит к спектральным изменениям. Увеличение концентрации этанола, диметилсульфоксида и №С1 вызывает следующие изменения: уменьшается интенсивность поглощения, уширяется спектр, то есть способствует ассоциации молекул фталоцианинов в растворе. Ассоциаты 2пРе(4-МИ—С6И4—СООМа)4 подвергаются деструкции только при добавлении сильных электронодонорных лигандов (пиридин, диэтиламин). В предельно разбавленных водных растворах (10-6 М) 2пРе(4-МИ-С6И4-СООМа)4, согласно электронным спектрам поглощения, реализуется равновесие мономер-димер, при добавлении ДМФА практически полностью смещающееся в сторону димеризации. Полученные таким образом димерные формы ZnPc(4-NИ—C6И4—COONa)4 проявляют слабую флуоресценцию.
Перечисленные спектральные изменения характерны для формирования в водных растворах ZnPc(4-NH—C6H4—COONa)4 1-агрегатов (рис. 3) [9]. Высокая устойчивость ассоциатов в растворе, вероятно, обусловлена координационной связью между центральным ионом металла одной молекулы фталоцианина и атомом азота периферийного заместителя другой молекулы фталоциани-на. Специфическая сольватация молекулами этанола периферийных заместителей фталоцианина при указанном на рис. 3 расположении молекул в составе ассоциата не оказывает негативного влияния на устойчивость ассоциативных структур.
На основании проведенных исследований выбраны условия для изучения особенностей взаи-
модействия липофильных фталоцианинов с БСА. Раствор фталоцианина в ДМФА добавлялся к раствору БСА в боратном буфере в различных объемных соотношениях. Максимальная концентрация ДМФА в растворе составляла 0.19 М. Для оценки влияния ДМФА на состояние БСА в растворе были проведены гидродинамические исследования растворов белка и осуществлена регистрация спектров флуоресценции. Полученные спектры флуоресценции БСА при облучении растворов светом с длиной волны 295 нм типичны для протеина в нативной конформации. Флуоресценция белка в нативном состоянии обусловлена наличием триптофановых остатков располагающихся в субдоменах 1В и 11А [10]. Титрование раствора БСА диметилформамидом в концентрации до 0.2 М не приводит к изменению спектра флуоресценции и, следовательно, к потере нативной конформации белка. Кинематическая вязкость растворов БСА при добавлении ДМФА изменяется в пределах погрешности.
Контроль состояния фталоцианина в смешанном растворителе (боратный буфер — ДМФА) осуществлялся методом электронной адсорбционной спектроскопии при добавлении раствора МГС в боратный буфер. Полученные спектры показали, что ZnPc(4-NH-C6H4-COONa)4 в концентрации до 10-7 находится в мономерном состоянии при всех соотношениях боратный буфер - ДМФА, а ZnPc(4-O-C6H4-COONa)4 является частично димеризованным. Нахождение ZnрPc(4рNH-C6H4-COONa)4 в растворе преимущественно в мономерном состоянии позволило провести расчет константы устойчивости комплекса ZnPc(4-NH-C6H4-COONa)4 - БСА и
ОБРАЗОВАНИЕ АССОЦИАТОВ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА
2073
определить количество сайтов связывания белка в координатах Скэтчарда. Титрование растворов БСА в боратном буфере раствором фталоцианина в ДМФА приводит к тушению флуоресценции белка. Учитывая, что тушение флуоресценции возможно при расстоянии между флуорофором и тушителем не более 10 нм [11], можно сделать вывод, что 2пРс(4-МН-С6Н4-СООМа)4 локализован в субдоменах 1В или 11А. Расчеты показали, что константа устойчивости комплекса ZnPc(4-NH— С6Н4-СООШ)4 с БСА 7.03 х 106, количество сайтов связывания белка с ZnPc(4-NH—C6H4—COONa)4 равно 3.
В связи с тем, что в смешанном растворителе ZnPc(4-O—C6H4—COONa)4 находится в димери-зованном состоянии, были проведены дополнительные кинетические исследования, предпосылками для них являлись собственные и литературные [12] сведения о диффузионном характере контроля процесса я—я-димеризации и сравнительно быстро протекающем процессе комплексо-образования МГС с БСА. Кинетические исследования проводили с помощью автоматической регистрации спектров с интервалом регистрации 5 с. Спектр флуоресце
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.