МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 5, с. 578-586
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.19:577.115
образование диацилглицерилтриметилгомосеринов
в поверхностной культуре базидиомицета гьлммиьтл
УЕЬиПРЕБ
© 2012 г. С. В. Сеник*, Е. Р. Котлова***, А. В. Новиков***, А. Л. Шаварда***,
Н. В. Псурцева*
*Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, Санкт-Петербург **Санкт-Петербургский государственный университет ***Институт аналитического приборостроения Российской академии наук, Санкт-Петербург
Поступила в редакцию: 16.01.2012 г.
В мицелии базидиального гриба ГЬттыНпа уеЫйрез, полученного путем поверхностного культивирования на агаризованном мальц-экстракте, обнаружены липиды бетаинового типа — диацилгли-церилтриметилгомосерины (ДГТС). Показано, что ДГТС накапливаются на поздних этапах развития культуры в условиях недостатка комплекса питательных элементов, в т.ч. азота, фосфора, калия и микроэлементов. Индукция синтеза бетаиновых липидов у Г. уеЫНрез происходит на фоне снижения интенсивности роста вегетативного мицелия, формирования монилиоидных гиф, ингибирова-ния плодообразования. Исследована зависимость образования ДГТС от факторов внешней среды (температуры, освещения). Установлено, что наиболее активная аккумуляция ДГТС происходит при температуре 15°С в отсутствие света.
Ключевые слова: ИаттыНпа уеЫйрез, базидиомицеты, поверхностная культура, мембранные липиды, бетаиновые липиды, диацилглицерилтриметилгомосерины.
Бетаиновые липиды впервые обнаружены у представителей отдела Chrisophyta [1]. В дальнейшем соединения этой группы были идентифицированы у многих видов зеленых и бурых водорослей, криптогамных растений, а также отдельных видов а-протеобактерий [2—4]. У грибов бетаиновые липиды, представленные одним классом соединений — диацилглицерилтриметилгомосерина-ми (ДГТС), были выявлены в плодовых телах дикорастущих аско- [5—7] и базидиомицетов [8—11].
Бетаиновые липиды являются структурными аналогами одного из основных мембранных фос-фоглицеролипидов — фосфатидилхолина (ФХ). Как и ФХ, они содержат триметиламмонийную группу в полярной части молекулы, но, в отличие от этого фосфолипида, не имеют остатка фосфорной кислоты. Образование бетаиновых липидов и ФХ происходит независимо [12]. Биосинтез ФХ осуществляется двумя альтернативными путями — в реакциях конденсации CDP-холина с диацилг-лицерином или трехступенчатого ^-метилирования фосфатидилэтаноламина (ФЭ) метилтрансфе-разами с использованием ^-аденозилметионина в качестве донора метильных групп. В клетках грибов образование ФХ происходит преимущественно путем метилирования ФЭ. Биосинтез бетаиновых
1 Автор для корреспонденции (e-mail: senik_sv@mail.ru).
липидов ДГТС включает присоединение гомосе-рина к диацилглицерину и последующее ^-метилирование образовавшегося диацилглицерилгомо-серина с участием метилтрансфераз и ¿-аденозил-метионина. На примере Rhodobacter sphaeroides и Clamydomonas reinhardtii показано, что у бактерий реакции конденсации и метилирования катализируются двумя отдельными ферментами, в то время как у зеленых водорослей — одним [13, 14]. Особенности биосинтеза бетаиновых липидов в клетках грибов детально не исследованы. Однако скрининг бактериальных и грибных геномов выявил наличие у Candida albicans и Aspergillus fumigatus последовательностей, гомологичных генам btaA и btaB, кодирующих ферменты биосинтеза ДГТС у бактерий [4].
Способность синтезировать бетаиновые липи-ды определенного класса, а также их соотношение с ФХ у водорослей и криптогамных растений рассматривают в качестве систематического признака [15]. Определенные корреляции между соотношением ДГТС/ФХ и систематическим положением вида прослеживаются и в системе аско- и базидиомицетов. Так, например, у базидиальных грибов из порядка Boletales ДГТС и ФХ являются основными мембранными липидами, у Agaricales (в основном, у видов семейства Tricholomataceae) ДГТС присутствуют лишь в качестве минорного
компонента, а у Russulales бетаиновые липиды вообще не синтезируются [8, 10, 11]. Однако мнение о таксономической значимости бетаиновых ли-пидов у грибов разделяют далеко не все авторы. Действительно, в отличие от фотосинтезирую-щих организмов, в пределах большинства порядков грибов можно обнаружить виды как синтезирующие, так и не синтезирующие ДГТС. В частности, такую гетерогенную по данному признаку группу составляют агарикоидные базидиомицеты [10, 11]. Каковы причины неустойчивого образования бетаиновых липидов у представителей данной систематической группы, пока неизвестно. Возможно, у грибов из порядка Agaricales накопление ДГТС происходит только в стрессовых условиях. По аналогии с другими организмами в качестве индуктора, запускающего синтез бетаиновых липидов, может выступать целый комплекс внешних и внутренних факторов, например, дефицит фосфора [16, 17] и обезвоживание [18].
У агарикоидного базидиомицета Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., штамм 1483, использованного в качестве модельного объекта в настоящей работе, образование ДГТС происходило в условиях поверхностного культивирования на агаризованных средах, приготовленных на основе солодовых (мальц) экстрактов производства "Biokar Diagnostics" и "Fluka". При этом бетаиновые липиды отсутствовали в мицелии и плодовых телах данного штамма, выращенных на сусло-агаре [19], а также в плодовых телах дикорастущей F. velutipes [11].
Цель работы состояла в выявлении факторов, обусловливающих накопление бетаиновых липи-дов у агарикоидного базидиомицета F. velutipes в ходе развития культуры и установлении взаимосвязи этого процесса с морфологией мицелия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали штамм 1483 базидиального гриба Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. из Коллекции культур базидио-мицетов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН. Образование плодовых тел у данного штамма происходит при температуре <21 °С на свету и зависит от состава среды. В коллекционном фонде штамм поддерживался методом суб-культу-ры на скошенном сусло-агаре при 4°С. Для экспериментов культуры выращивали в чашках Петри на агаризованной среде, приготовленной на основе солодового (мальц) экстракта "Biokar Diagnostics" (Франция) (мальц-экстракт — 15 г/л, агар — 20 г/л). Посев производили в центр чашки Петри мицели-альным диском (мицелием вниз), взятым из растущего края 9-сут. колонии. Культивирование проводили в течение 9 сут в термостате при 25°С, затем чашки с мицелием переносили в климатическую камеру (Sanyo MLR-351H, Япония) с температу-
рой 10, 15 или 20°С. Культивирование в камере проводили в темноте или при освещении 2000 лк (световой режим 12 : 12). Для анализа липидов использовали 9-, 15-, 21- и 39-суточный вегетативный мицелий. Также, для сравнения, были проанализированы культуры в возрасте 7, 21 и 39 сут, выращенные аналогичным способом на агаризо-ванных средах с мальц-экстрактом "Fluka" (Германия) (мальц-экстракт — 15 г/л, агар — 20 г/л), концентратом сусла "Senson" (Финляндия) (солодовый экстракт Maltax 10, разведенный ди-стилированной водой до 4° по Баллингу — 1 л, агар — 15 г) и нативным неохмеленным суслом производства Василеостровской пивоварни (Россия) (сусло, разведенное дистилированной водой до 4° по Баллингу — 1 л, агар — 15 г).
Микроморфологию мицелия изучали с помощью световой микроскопии с использованием дифференциально-интерференционного контрастирования (DIC) Carl Zeiss Axio Scope A1. Анализировали состояние мицелия в разных участках колонии (центральная и краевая зоны). Макроморфологию колоний описывали согласно стандартной методике [20].
Экстракцию липидов проводили по методу Ни-колса [21] с модификациями [19]. Для этого мицелий гомогенизировали с изопропанолом, нагревали 30 мин при 70°С и центрифугировали. Суперна-тант отбирали, а из полученного осадка извлекали оставшиеся липиды — сначала изопропанолом, затем смесью изопропанол—хлороформ (1 : 1). Объединенные экстракты упаривали в роторном испарителе, растворяли в 3 мл смеси хлороформ-метанол (1 : 1), добавляли 4 мл 2.5% NaCl в воде и центрифугировали. Из образовавшейся двухфазной системы отбирали хлороформный слой, содержащий липиды.
Индивидуальные классы фосфо-, бетаиновых и сфинголипидов анализировали с помощью ТСХ на пластинах 10 х 10 см ("Merck", Германия) в системе растворителей: хлороформ—метанол—вода (65 : 25 : 4) в первом направлении и хлороформ—ацетон—метанол—уксусная кислота—вода (50 : 20 : 10 : 10 : 5) — во втором направлении [16]. Хроматографические зоны, соответствующие ли-пидным соединениям, визуализировали, в зависимости от цели исследования, с помощью 5% раствора H2SO4 в метаноле или паров йода. Липиды идентифицировали, используя стандартные свидетели и специфические реагенты на отдельные функциональные группы [22]. Количество глицеро- и сфинголипидов определяли денситометрически с использованием прибора Денскан ("Ленхром", Россия). Расчет содержания отдельных классов ли-пидов на хроматограммах проводили с помощью программы DENS-14-12-03 в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым, по-
Таблица 1. Содержание макро- и микроэлементов в органических субстратах* питательных сред, использованных для культивирования Г. уеЫйрез
Питательная среда Макроэлементы, мг/л Микроэлементы, мкг/л
N Р K Mg Fe Zn Cu
Мальц-агар 1 81 52 55 0.25 0.06 21 3.2
Мальц-агар 2 62 40 87 0.15 0.09 74 2.1
Сусло-агар 1 140 98 224 2.03 0.53 119 82.4
Сусло-агар 2 166 104 120 1.60 1.45 109 28.2
* Приведены значения содержания макро- и микроэлементов в 1 л жидкой питательной среды (без агара). Мальц-агар 1 — среда на основе мальц-экстракта "Biokar Diagnostics" (Франция); Мальц-агар 2 — среда на основе мальц-экстракта "Fluka" (Германия); Сусло-агар 1 — среда на основе концентрата сусла "Maltax 10 Senson" (Финляндия); Сусло-агар 2 — среда на основе неохмеленного пивного сусла Василеостровской пивоварни (Россия).
строенным по стандартным растворам ФХ и цере-брозидов ("Sigma", Германия).
Состав молекулярных видов ФХ и ДГТС определяли по значению m/z с использованием времяпролетного масс-спектроме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.