ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 1, с. 53-58
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОБРАЗОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ 2,4-Д И НУК
© 2009 г. Т. Н. Николаева, Н. В. Загоскина,
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 22.01.2008 г.
Изучали действие гормоноподобных соединений в различных концентрациях: 2,4-Д (2 х 10-6, 2 х 10-5 и 2 х 10-4 М) и 1-НУК (2 х 10-7, 2 х 10-6, 2 х 10-5, 4 х 10-5 и 6 х 10-5 М) на рост и образование фенольных соединений, в том числе флаванов и лигнина, в каллусной культуре чайного растения (Camellia sinensis L., высокопродуктивный штамм ИФР ЧС-2). Оптимальной для роста культуры и образования в ней фенольных соединений оказалась среда, содержавшая 2 х 10-5 М 2,4-Д. Замена 2,4-Д на 1-НУК во всех случаях снижала рост культуры. В большей степени эти изменения проявлялись при использовании 2 х 10-7 и 2 х 10-6 М 1-НУК, когда прирост биомассы снижался в 1.5-2.0 раза по сравнению с контролем, растущим на среде с 2 х 10-5 М 2,4-Д. В присутствии 1-НУК в каллусах увеличивалось содержание суммы растворимых фенольных соединений и флаванов (в среднем лишь на 30% по сравнению с контрольным вариантом). Накопление же лигнина практически не менялось. Следовательно, замена 2,4-Д на 1-НУК в составе питательной среды, используемой для роста высокопродуктивного штамма каллусной культуры чайного растения, приводила к незначительным изменениям в их способности к образованию фенольных соединений.
М. Н. Запрометов
Ключевые слова: Camellia sinensis - чайное растение - каллусные культуры - гормоноподобные соединения - фенольные соединения - флаваны - лигнин.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из характерных особенностей высших растений является способность к синтезу разнообразных вторичных метаболитов [1, 2]. К числу наиболее распространенных относятся фенольные соединения, которые обладают высокой биологической активностью и часто используются в качестве лечебных препаратов [3]. Они синтезируются и в культивируемых in vitro клетках и тканях растений [4]. Однако их содержание часто оказывается ниже, чем в исходных эксплантах [5, 6]. В связи с этим, важным моментом является подбор условий, способствующих их накоплению.
К наиболее значимым регуляторам синтеза вторичных соединений в клеточных культурах растений относятся такие компоненты питательных сред, как гормоны и гормоноподобные соединения [4, 7]. В качестве ауксинов обычно используют 2,4-Д или 1-НУК. К настоящему времени становится все более очевидным, что они не являются взаимозаменяемыми соединениями [8]. Это проявляется в различиях их действия на физиологические и биохимические
Адрес для корреспонденции: Николаева Татьяна Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: phenolic@ippras.ru
процессы, происходящие в культивируемых in vitro клетках растений.
2,4-Д, как правило, способствует активной пролиферации клеток и стабильному росту каллусных и суспензионных культур [7]. При этом интенсивность каллусообразования зависит от концентрации 2,4-Д, а также от сортовых характеристик растений, что отмечалось при культивировании девяти сортов овса [9]. Сообщалось также, что у интенсивно растущих каллусов пшеницы и ячменя 2,4-Д в высоких концентрациях ингибировала рост клеток растяжением, но стимулировали клеточные деления [10]. В культуре клеток табака максимальное количество делений наблюдали при концентрациях 2,4-Д, на порядок превышающей таковую у НУК [11]. В случае внесения в питательную среду НУК (вместо 2,4-Д или в сочетании с ней) часто отмечали стимуляцию синтеза вторичных метаболитов. Так, в культуре ткани василистника малого происходило двукратное увеличение образования алкалоида берберина [12], а в культуре клеток женьшеня настоящего возрастало содержание гинзенозидов [13]. Все это свидетельствует об изменениях в характере роста и синтеза соединений вторичного метаболизма у культивируемых in vitro клеток растений.
Подходящим объектом для изучения фенольно-го метаболизма и его регуляции являются растения
чая и инициированные из них каллусные культуры, характеризующиеся специализированным метаболизмом, направленным на синтез фенилпропанои-дов, флавоноидов и лигнина [14, 15]. Как было показано ранее, на среде с 2,4-Д отмечался хороший рост гетеротрофного каллуса чайного растения (штамм ИФР ЧС-1) и образование в нем фенольных соединений [16]. При ее замене на НУК содержание суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и лигнина в культуре возрастало на фоне некоторого подавления роста [17]. В процессе пассирования у штамма ИФР ЧС-1 происходило значительное снижение способности к синтезу соединений феноль-ной природы, что, вероятно, обусловлено изменением его генетических характеристик за счет полипло-идизации клеток [18]. В дальнейшем был получен другой штамм (ИФР ЧС-2), при инициации и последующем культивировании которого использовали те же способы и подходы, что и при получении штамма ИФР ЧС-1. Его характерной особенностью являлось высокое содержание фенольных соединений, а также преобладание в клеточной популяции диплоидных клеток, характерных для чайного растения [18]. Поскольку оба штамма имели одинаковое происхождение и были получены из стебля молодых флешей, то, судя по имеющимся в литературе данным [4, 7], велика вероятность их одинаковой реакции на гормональный состав питательной среды. В то же время, в литературе имеются данные о том, что эндогенный уровень фенольных соединений в клетках растений имеет большое значение для их ответной реакции на изменение условий роста и развития [19].
В связи с этим, целью настоящего исследования являлось сравнение действия 2,4-Д и НУК в различных концентрациях на рост высокопродуктивного штамма каллусной культуры чайного растения и образование в каллусной культуре полифенолов. Это позволило бы выяснить "зависимость" накопления этих продуктов вторичного метаболизма от гормонального состава питательной среды.
МЕТОДИКА
В работе использовали каллусную культуру стебля чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность; штамм ИФР ЧС-2). Культуру выращивали в темноте при 26°C на ранее подобранной модифицированной питательной среде Хелле-ра, содержавшей 2 х 10-5 М 2,4-Д и 2.5% глюкозы [16]. При проведении опытов в питательную среду вносили 2,4-Д (2 х 10-6, 2 х 10-5 и 2 х 10-4 М) или НУК (2 х10-7, 2 х 10-6, 2 х 10-5, 4 х 10-5 и 6 х 10-5 М).
Индекс роста определяли на 28-й день культивирования и рассчитывали, как отношение Xmax/Xo, где X - сухая масса соответственно в конце и в начале эксперимента. Исходная масса каллусов составляла 200-220 мг. Повторность в вариантах - 10-кратная.
Фенольные соединения извлекали из лиофильно высушенного материала горячим 96% этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли суммарное содержание растворимых фенольных соединений (с реактивом Фолина-Дени-са, поглощение при 725 нм) и содержание флаванов (с ванилиновым реактивом, поглощение при 525 нм) [20]. Калибровочные кривые в обоих случаях строили по (-)-эпикатехину.
Для определения лигнина лиофильно высушенную ткань последовательно экстрагировали 96% этанолом (горячая экстракция, 1 ч), смесью этанол : бензол (1 : 2) (4-6 ч), горячей водой (95°С, 2 ч), а затем промывали этанолом и эфиром. Полученный таким образом свободный от экстрактивных веществ остаток гидролизовали 0.5 N КаОН в течение 36 ч при 80°С. Охлажденный гидролизат центрифугировали (1000 g, 10 мин), и в надосадоч-ной жидкости определяли спектрофотометрически содержание лигнина по реакции с 2,6-дихлорхинон-хлоримидом (при 610 нм) [21]. Калибровочную кривую строили по феруловой кислоте.
В работе использовали реактивы фирмы "Serva" (Германия) - 2,4-Д, ванилин, (-)-эпикатехин, феру-ловую кислоту, 2,6-дихлорхинонхлоримид, флоро-глюцин. Остальные реактивы были отечественного производства (квалификации "х. ч." и "ч. д. а.").
На рисунках представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения. Для каждого определения брали по три каллуса в трех аналитических повторностях. Анализ проводили во время двух последовательных пассажей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для культивирования высокопродуктивного штамма гетеротрофной каллусной культуры стебля чайного растения (ИФР ЧС-2) использовали основную питательную среду, ранее подобранную для низкопродуктивного штамма ИФР ЧС-1 аналогичного происхождения [16]. Поскольку эти штаммы отличались по многим характеристикам [18], то в первую очередь следовало выяснить реакцию штамма ИФР ЧС-2 на различные концентрации 2,4-Д в питательной среде. Основываясь на данных предыдущих исследований [16], мы остановили свой выбор на трех из них - 2 х 10-6, 2 х 10-5 и 2 х 10-4 М.
Как следует из представленных на рис. 1 данных, наилучший рост штамма ИФР ЧС-2 отмечали на среде с 2 х 10-5 М 2,4-Д, что было характерно и для штамма ИФР ЧС-1 [16]. Культура достаточно хорошо росла и при добавлении 2 х 10-4 М 2,4-Д, чего нельзя сказать о самой низкой из использованных концентраций (2 х 10-6 М). В последнем случае прирост каллусной массы к 28-му дню культивирования был почти в 1.5 раза ниже, чем на среде с 2 х 10-5 М 2,4-Д. Возможно, такой концентрации соединения ауксиновой природы недостаточно для поддержа-
350 300
#
о 250
м
м
н
«
о я о н о
о рц
150
100
50
70 г
II
Вариант
III
Рис. 1. Прирост биомассы гетеротрофной каллусной культуры стебля чайного растения, выращиваемой на средах с различными концентрациями 2,4-Д. I - 2 х 10-4, II - 2 х 10-5, III - 2 х 10-6 М.
ния роста культуры чайного растения. О том, что при малых концентрациях гормонов в питательной среде снижается пролиферация клеточных культур, сообщалось и ранее [4, 7].
Каллусные культуры чайного растения синтезируют разнообразные фенольные соединения, в том числе и характерные для чая флаваны, а также лигнин. Как следует из представленных на рис. 2а данных, при содержании 2,4-Д в питательной среде в концентрациях 2 х 10-6 или 2 х 10-5 М накопление суммы растворимых фенольных соединений
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.