МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 344-351
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.355.3
ОБРАЗОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ 55 кДА ПРИ НАРУШЕНИИ КООРДИНАЦИОННЫХ СВЯЗЕЙ И ГИДРОФОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПЕРИФЕРИЙНЫХ СВЕТОСОБИРАЮЩИХ КОМПЛЕКСАХ ИЗ ПУРПУРНЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
© 2015 г. А. А. Соловьев1, Ю. Е. Ерохин
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 10.09.2014 г.
Методом гель-хроматографии проведена сравнительная оценка размеров нативных и дифениламино-вых (ДФА) с подавленным синтезом каротиноидов периферийных светособирающих комплексов (ЬЫ2-комплексов) из серной бактерии Allochromatium minutissimum. Оба комплекса имеют одинаковые объемы выхода Ve, которые совпали с объемом выхода ЬЫ2-комплекса из Rhodoblastus acidophilus (штамм 10050), и являются нонамерами. Их молекулярный вес составляет 150 кДа. Феофитини-зация бактериохлорофилла (БХл) при низких значениях pH, а также действие детергента LDAO, нарушающего гидрофобные взаимодействия между соседними протомерами, приводят к фрагментации кольца выделенных ЦЫ2-комплексов с образованием фрагментов 55 кДа, по молекулярным весам соответствующих одной трети от исходного молекулярного веса. Отмечено, что фрагментация как при фео-фитинизации БХл, так и при действии детергента многократно ускоряется в ДФА ЦЫ2-комплексах по сравнению с нативными. Фрагменты 55 кДа, образовавшиеся при низком значении pH, содержат мономерный бактериофеофитин, а аналогичные по молекулярному весу фрагменты, образовавшиеся в результате действия детергента при pH 8.0, содержат мономерный БХл. Высказано предположение, что наблюдаемая фрагментация есть отражение присущей для ЦЫ2-комплексов С3-симмет-рии, и "строительным блоком" для них является предварительно собранный тример.
Ключевые слова: спектры поглощения, гель-проникающая хроматография, электрофорез, бактериальный фотосинтез, ЬЫ2-комплексы, ЛПоскготайыт ттыНззтыт.
DOI: 10.7868/S0026365615030192
Без эффективного захвата солнечной энергии светособирающими антеннами фотосинтез был бы невозможен. Антенны следует рассматривать как одни из важнейших биологических супрамо-лекулярных комплексов [1]. К настоящему времени из всех видов светособирающих антенн со структурной и функциональной точек зрения наиболее исследованы прицентровые и периферические антенны пурпурных фотосинтезирующих бактерий (LH1- и LH2-комплексы соответственно). Они являются удобными объектами для изучения основных принципов поглощения энергии квантов света, преобразования ее в энергию возбуждения электронов и миграции этой энергии по молекулам бактериохлорофилла (БХл) к реакционным центрам (RC) [2, 3]. Для LH2-комплексов [4—6] и ансамблей LH1 с RC (RC-LH1) [7] установлена пространственная структура с высоким разрешением. Оба антенных комплекса построены по универсальному блочному принципу и состоят из прото-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: alex_1_i@mail.ru).
меров — гетеродимеров а- и Р-полипептидных цепей и связанных с ними молекул БХл и каротиноидов; структура а- и Р-полипептидов гомологична [2, 3, 8, 9]. Протомеры агрегируют с образованием цилиндрических структур: цепи а-полипеп-тидов образуют в мембране плотный внутренний цилиндр, который стабилизирован взаимодействиями между спиралями; Р-цепи образуют более рыхлый внешний цилиндр, в котором расстояния между полипептидами не допускают прямых Р-Р-взаимодействий. Перекрывающиеся порфириновые кольца димеров молекул БХл находятся между цилиндрами, сформированными а- и Р-полипептидами, перпендикулярно плоскости мембраны, по одному димеру БХл на каждый аР-гетеродимер, и образуют единый экситонный ансамбль, поглощающий при 850 или 880 нм для ЬЫ2- и ЬЫ1-комплексов соответственно [8, 9]. В ЬЫ2-комплексах имеются, кроме того, молекулы БХл, поглощающие при 800 нм, расположенные между цепями Р-полипептидов, с плоскостями порфириновых колец, параллельными плоскости
мембраны [4] или под углом 20° к ней [6]. Замкнутая цилиндрическая структура ЬИ2-комплекса — полая [4—6]. Внутри цилиндрической структуры ЬИ1-комплекса расположен ЯС [7].
Способность центрального иона М§2+ (Б)Хл координационно взаимодействовать с аминокислотными остатками рассматривается как решающий фактор в сборке (Б)Хл-белков. Эксперименты с направленным мутагенезом свидетельствуют о том, что наличие координационных связей М§ с гистидиновыми остатками а- и Р-пептидов является необходимым условием существования на-тивной структуры ЬИ2-комплекса Rhodobacter sphaeroides [10]. Исследования феофитинизации БХл и агрегации образующегося бактериофеофи-тина (БФео) и анализ фрагментов, образующихся в ходе этого процесса, также свидетельствуют о структуроформирующей и удерживающей роли агрегированных форм БХл в организации антенных комплексов Allochromatium minutissimum [11].
В стабилизации структуры ЬИ1- и ЬИ2-ком-плексов ключевую роль играют также гидрофобные взаимодействия пептидов и полиеновых цепочек каротиноидов и фитолов БХл. Между спиралями а- и Р-полипептидов непосредственное взаимодействие имеет место только на N и С-концах. Внутри погруженных в мембрану частей этих спиралей взаимодействие между ними опосредовано через молекулы пигментов и связанной воды [4—9]. Каротиноиды контактируют с а- и Р-цепями полипептидов, фитольными цепями молекул БХл и их порфириновыми кольцами и повышают структурную стабильность комплексов. Они сцепляют соседние пары а- и Р-поли-пептидов. Показано, что в отсутствие каротиноидов сборка ЬИ2-комплексов в несерных пурпурных бактериях не происходит [12, 13]. Однако в серных бактериях Alc. minutissimum и Ectothiorho-dospira haloalkaliphila сборка полностью бескароти-ноидных ЬИ2-комплексов в присутствии ингибитора биосинтеза каротиноидов, дифениламина (ДФА), имеет место, и эти комплексы могут быть выделены в чистом виде с применением стандартных биохимических процедур, хотя каротиноиды важны для стабильности ЬИ2-комплексов [14, 15].
В предыдущей работе было показано, что нарушение координационных связей М§ с гистиди-новыми остатками при феофитинизации БХл разрушает исходную упорядоченную макроструктуру этих комплексов. Показано, что мономерный БФео распределяется между белковыми фрагментами, состоящими из а- и Р-пептидов, а агрегированный БФео тяготеет к внутреннему плотному остову ЬИ2-комплекса, образованному а-пептидами [11].
Целью работы было рассмотреть спектральные и структурные изменения в ЬИ2-комплексах при действии на них детергентов, изменяющих гидро-
фобные взаимодействия в нативных мембранах и изолированных протеиновых структурах, и сопоставить эти изменения с фрагментацией ЬИ2-ком-плексов, вызванной феофитинизацией БХл и элиминированием координационных связей Mg c гистидиновыми остатками а- и Р-пептидов [11]. Особый интерес в этом контексте представляло сравнение поведения нативных образцов ЬИ2-ком-плексов и их бескаротиноидных ДФА-аналогов.
В качестве объектов исследования были использованы ЬИ2-комплексы, выделенные из хро-матофоров Alc. minutissimum как нативных, так и дифениламиновых (ДФА).
Для разделения и анализа продуктов деструкции светособирающих комплексов применен метод гель-хроматографии, поскольку в отличие от метода гель-электрофореза, примененного в [11], гель-хроматография обеспечивает определение молекулярного веса или размера (стоксовского радиуса) нативных и денатурированных белков в широком диапазоне pH, ионной силы и температуры и свободна от ограничений, налагаемых зарядовым состоянием молекул.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактерии Allochromatium minutissimum (КМ МГУ) и Rhodoblastus acidophilus (штамм 10050) (DSMZ) выращивали в видоизмененной среде Ларсена [16] и Пфеннига [17], соответственно, при температуре 28 ± 2°C и непрерывном освещении (интенсивность света 90 Вт/м2). Клеточную биомассу собирали в начале стационарной фазы. Для получения клеток Alc. minutissimum с подавленным синтезом каротиноидов в среду для выращивания добавляли ДФА в концентрации 9 мг/л [18]. Степень подавления синтеза каротиноидов составляла 85%.
Хроматофоры Alc. minutissimum [11, 19, 20] и фрагменты мембран Rbl. acidophilus [21] выделяли центрифугированием после озвучивания клеток с применением ультразвукового генератора УЗГ13-0.1/22. Осадки ресуспендировали в 0.05 М буфере трис-HCl, pH 8.0.
Выделение ЬИ2-комплексов из Alc. minutissimum и Rbl. acidophilus проводили в системе Matson [22] в 7%-ном ПААГ, как описано в [11, 19, 20] с применением детергентов тритона Х100 или Р-додецилмальтозида ф-DM). Солюбилизацию хроматофоров в тритоне X100 проводили при 4°C в течение 2 ч при концентрации детергента 3.3%. Солюбилизацию хроматофоров в P-DM проводили при комнатной температуре в течение 30—40 мин при концентрации детергента 2.7%. ДФА хроматофоры из Alc. minutissimum солюбилизировали в тритоне X100 при 4°C в течение 30 мин и концентрации детергента 1.2% или в P-DM при комнатной температуре в течение 30 мин и концентра-
. 1.25 г
Контроль 15 мин 40 мин 4 ч 30 мин 45 ч
300 400 500 600 700 800 Длина волны, нм
900 1000
Рис. 1. Изменения в спектрах поглощения ДФА ЬН2-комплексов из А1с. minutissimum в присутствии 0.1% ЬЭАО. Длина оптического пути — 1 см.
Гель-хроматографию образцов проводили на колонке с сефакрилом S-200 (диаметр 0.9 см, длина 95 см) с использованием 0.01 M буфера трис-HC1 pH 8.0 с добавлением 0.1% LDAO и 0.15 M NaCl для подавления возможных неспецифических ионных взаимодействий белков с матрицей геля. Колонка была прокалибрована с использованием белков-маркеров "Serva" и "Sigma" в той же самой среде. Скорость элюции составляла 0.15 мл/мин.
В работе использовали трис-буферы фирмы "Sigma" (США), p-DM фирмы "Anatrace" (США), тритон X100 фирмы "Merck" (ФРГ), додецил-сульфат натрия (DS-Na) фирмы "Serva" (ФРГ), LDAO, акриламид, метилен-5ис-акриламид и глицин фирмы "Fluka" (Швейцария), трицин фирмы "AppliChem" (ФРГ).
Спектры оптического поглощения растворов и гелей записывали на спектрофотометре Cary 50 "Varian" (Австралия).
ции детергента 0.9%. Солюбилизацию фрагментов мембран Rbl. acidophilus проводили в P-DM при комнатной температуре в течение 20 мин при концентрации детерген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.