= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8.06
ОБРАЗОВАНИЕ И ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА В МЕРОМИКТИЧЕСКОМ
ОЗЕРЕ ГЁК-ГЁЛЬ (АЗЕРБАЙДЖАН)
© 2010 г. Н. В. Пименов*, 1, А. Ю. Каллистова*, И. И. Русанов*, С. К. Юсупов*, Л. Монтонен**, Г. Юргенс**, У. Мюнстер***, А. Н. Ножевникова*, М. В. Иванов*
*Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Факультет прикладной химии и микробиологии, Университет Хельсинки, Финляндия ***Институт инженерии и биотехнологии окружающей среды, Технологический университет Тампере, Финляндия
Поступила в редакцию 29.09.2009 г.
С помощью радиоизотопных, молекулярных и микробиологических методов исследовали продукцию, окисление метана и разнообразие культивируемых аэробных метанотрофных бактерий в водной толще и поверхностных осадках меромиктического олиготрофного озера Гек-Гель (Азербайджан). Скорость окисления метана была чрезвычайно низкой в аэробном миксолимнионе, резко увеличивалась в хемо-клине и достигала максимума на границе появления кислорода в водной толще. В накопительных культурах, выделенных из хемоклина, идентифицированы аэробные метанотрофные бактерии II типа, принадлежащие к роду ЫеЩ\осу$И$. Окисление метана в анаэробных водах монимолимниона было гораздо более интенсивным, чем в аэробной зоне. Тем не менее, глубже 29—30 м происходило нарастание содержания метана, которое у дна достигало величины 68 мкМ. Наибольшая скорость окисления метана в анаэробных условиях наблюдалась в поверхностном слое донных осадков. Значительное превышение скорости окисления метана над его образованием в поверхностных осадках и водной толще указывало на глубинный источник метана в этом озере.
Ключевые слова: меромиктическое олиготрофное озеро Гек-Гель, метаногенез, окисление метана, мета-нотрофные бактерии.
Меромиктические озера являются важными и интересными объектами для исследования микробной экологии. Благодаря физико-химической стабильности водных масс и относительно постоянной вертикальной стратификации микробных популяций, такие озера служат удобной моделью для изучения структуры микробных сообществ. В меромиктических озерах заметное повышение численности и биоразнообразия микроорганизмов обычно наблюдается в хемоклине на границе аэробной и анаэробной зон, ниже которой сохраняются стабильные анаэробные условия. Как правило, анаэробная зона пресных и соленых меромиктических озер характеризуется присутствием свободного сероводорода, образование которого определяется активностью сульфатредуци-рующих прокариот [1, 2].
Для анаэробного монимолимниона меромикти-ческих озер также характерна высокая концентрация метана, образующегося за счет жизнедеятельности метаногенных архей. Содержание метана обычно резко снижается в хемоклине, где наблюдаются максимальные скорости его аэробного окисления, и остается низким в аэробном миксолимнионе [3]. Аэробные метанотрофные бактерии потребляют
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: npimenov@mail.ru).
значительную часть метана, образующегося в анаэробной зоне озера, и обеспечивают возврат углерода в пищевую цепь, препятствуя, таким образом, эмиссии метана в атмосферу [4, 5]. Наряду с аэробным окислением метана, в стратифицированных озерах, содержащих достаточное количество сульфат-иона, обнаружена высокая скорость анаэробного окисления метана в монимолимнионе и верхнем горизонте донных осадков [2, 6—8]. Анаэробное окисление метана, вероятнее всего, происходит по пути, обратному метаногенезу с сульфатом в качестве конечного акцептора электронов, и осуществляется консорциумом метанотрофных архей и сульфатредуцирую-щих бактерий [9, 10]. Клетки анаэробных метанотрофных архей были зарегистрированы методом CARD-FISH в водной толще пресноводного стратифицированного озера Плюсзее (Plupsee) [11]. Анаэробное окисление метана, которое не зависело от деятельности сульфатредуцирующих бактерий и, по предположению авторов, осуществлялось консорциумом метанотрофных архей (ANME II) и денитрифицирующих бактерий, было обнаружено в осадках из пресноводного канала [12]. Совсем недавно получены доказательства того, что денитрифицирующие бактерии способны к анаэробному окислению метана, связанному с восстановлением нитрата в молекулярный азот без участия архей [13]. Таким
образом, согласно последним данным, нельзя исключить существования анаэробного окисления метана в анаэробных зонах водоемов с низким содержанием сульфатов.
Меромиктическое олиготрофное озеро Гёк-Гёль расположено в Кавказских горах (Азербайджан) на высоте 1650 м над уровнем моря. Оно образовалось в XII веке в долине реки Аг-Су в результате землетрясения. Площадь поверхности озера составляет 1.25 км2, максимальная глубина — 92 м. Озеро характеризуется выраженной температурной и химической стратификацией. Свободный сероводород появляется с глубины 29—30 м и в придонных горизонтах достигает величины 4.0—4.5 мг л-1. Содержание сульфат-иона в водной толще озера варьирует от 30 до 50 мг л-1. Ранее в озере Гёк-Гёль проводили исследования физико-химических параметров воды, фотосинтеза, хемосинтеза, численности и разнообразия гетеротрофных, фотосинтезирующих, желе-зоокисляющих, сульфатвосстанавливающих бактерий, а также зоопланктона [14-17]. Однако до сих пор в литературе отсутствуют данные о цикле метана в этом озере.
Целью настоящей работы было исследование содержания метана, скоростей его образования и окисления в водной толще и верхнем слое донных осадков озера Гёк-Гёль с помощью биогеохимических методов, а также выявление аэробных метано-трофных бактерий путем получения накопительных культур с последующей их идентификацией молекулярными методами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работы на озере Гёк-Гёль проводили в сентябре 2003 г. в точке с глубиной 72 м (40°24.706'М, 46° 19.696' Е).
Пробы воды отбирали 1-литровым стеклянным батометром, поверхностные осадки - лимнологическим стратометром с трубкой диаметром 4 см и длиной 40 см, сделанной из оргстекла. Немедленно после отбора в пробах воды измеряли содержание кислорода методом Винклера и сероводорода стан-дарным набором реактивов ("Лдияшегек", Германия), а также отбирали образцы для определения содержания метана газохроматографическим методом на газовом хроматографе (ГХ) ХРОМ 5 с пламенно-ионизационным детектором.
Измерение скорости процессов продукции и окисления метана в водной толще и донных осадках проводили радиоизотопным методом. В качестве субстрата для измерения гидрогенотрофного мета-ногенеза использовали №Н14С03, для ацетокласти-ческого — 14С-ацетат, меченый по метильной группе. Скорость окисления метана определяли с 14С-мета-ном. При исследовании водной толщи инкубацию проб с мечеными субстратами проводили в течение 24 ч в 30-мл пенициллиновых флаконах, герметич-
но закрытых без пузырька воздуха пробкой из газонепроницаемой бутиловой резины. Необходимую температуру инкубации поддерживали, вывешивая склянки на капроновом тросе на той глубине, откуда отбирали соответствующую пробу.
Образцы донных осадков помещали без доступа воздуха в 5-мл пластиковые шприцы с обрезанным концом, закрывали пробкой из газонепроницаемой бутиловой резины и инкубировали в холодильнике в течение 24 ч при температуре 5°С, близкой к температуре in situ.
В пробы воды и осадков туберкулиновым шприцем вводили 0.2 мл водных растворов 14С-бикарбо-ната, 14С-ацетата и 14С-метана с конечной радиоактивностью в пробах 10, 15 и 2 мкКи соответственно. Отбор проб и измерение скорости сульфатредукции в осадках озера проводили радиоизотопным методом аналогично определению интенсивности процессов цикла метана с использованием 35S-SO2 (конечная концентрация в пробе 20 мкКи).
Немедленно после завершения инкубации образцы фиксировали 1 мл 2 N раствора NaOH и транспортировали в стационарную лабораторию ИНМИ РАН. Дальнейшую обработку проб проводили по методам, подробно описанным ранее [18, 19].
Аэробные метанотрофные бактерии культивировали в жидкой минеральной среде "П" [20]. Для этого в 20-мл флаконы с 5 мл стерильной среды и 10 об. % метана в газовой фазе добавляли 5 мл озерной воды, отобранной с соответствующей глубины. Склянки инкубировали в темноте при 20°С в течение 2 месяцев. Рост метанотрофов оценивали по убыли внесенного метана газохроматографически на ГХ ХРОМ 5. После обнаружения признаков роста, накопительные культуры пересевали каждые три недели на среду того же состава.
Общую ДНК из накопительных культур выделяли методом, основанным на использовании гекса-децилтриметиламмониум бромида [21].
ПЦР-амплификацию фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили с использованием универсальных бактериальных праймеров GC984F, 984F и 1492R [22]. Исследуемый образец ДНК (1—3 мкл) вносили в реакционную смесь (30 мкл), содержавшую 0.75 мкл смеси dNTP (10 мМ, "Finnzymes", Финляндия), 1.2 мкл каждого праймера (20 пмоль мкл-1), 3 мкл 10х буфера для DyNAzyme™ II ДНК-полимеразы ("Finnzymes", Финляндия), 0.45 мкл DyNAzyme™ II ДНК-поли-меразы (2 ед мкл-1, "Finnzymes", Финляндия). ПЦР проводили с использованием термоциклера Eppendorf Master Cycler Gradient (Германия) по следующей программе: (1) начальная денатурация при 95°C в течение 4 мин; (2) 38 циклов денатурации (40 с при 94°C), отжига (1.5 мин при 55°C) и элонгации (2.5 мин при 72°С); (3) конечная элон-
0.1
(а) O2, H2S, ммоль/л 0.2 0.3 0.4
10
20 м
сТ 30 я
и
%40 £
50 60 70
> 1
X
ч
/ / /
! з
2
I
20 40 60 80
CH4, мкмоль/л; T°C
(б) нмоль/(л сут)
5 10 15 20 25 30
10
20 м
Í30 луби40
£
50 60 70
Рис. 1. а — профили распределения температуры, О2, и СН4 в водной толще озера Гёк-Гёль: 1 — О2; 2 — 3 — СН4; 4 — температура °С; б — скорости образования (1) и окисления (2) метана в водной толще озера Гёк-Гёль.
гация при 72°С в течение 15 мин. ПЦР-продукты анализировали путем электрофореза в 1.5% ага-розном геле, окрашенном бромистым этидием (0.2 мг л-1) и визуализировали с помощью УФ-трансиллюминатора.
ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами GC984F и 1492R, разделяли методом денатурирующего гель-электрофореза в 6% акриламидном геле, содержавшем линейный градиент (от 30 д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.