ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2007, № 8, с. 961-967
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.46
ОБРАЗОВАНИЕ МЕТАНА И РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ВЛАЖНОСТИ ПОЧВ С ВНЕСЕНИЕМ И БЕЗ ВНЕСЕНИЯ ХИТИНА*
© 2007 г. Н. А. Манучарова, А. М. Ярославцев, Е. Г. Корнюшенко, А. Л. Степанов, А. В. Смагин, Д. Г. Звягинцев, И. И. Судницын
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы
E-mail: manucharova@mail.ru Поступила в редакцию 07.07.2006 г.
Установлены границы влажности почв, при которых возможно образование метана и рост микроорганизмов в почвах с добавлением хитина и без него. Исследовали образцы серой лесной, дерново-подзолистой, каштановой, глеетаежной почв и чернозема. Обнаружено значительное возрастание эмиссии метана в присутствии хитина при высокой влажности почв. Увеличение влажности почвы до полной влагоемкости приводило к возрастанию эмиссии метана от 2 до 6 раз. Газохроматогра-фическим методом изучена динамика эмиссии метана из почв в ходе сукцессии, инициированной внесением хитина и разной степенью увлажнения. Методом люминесцентной микроскопии определена численность и биомасса грибного, бактериального и актиномицетного комплексов при разной влажности. Установлено, что в процессе трансформации хитина в почвах в условиях недостатка кислорода (повышенной влажности) участвуют многие микроорганизмы. Наиболее активно наращивающей биомассу группой являются прокариоты, среди которых преобладают актиномицеты (отмечено удвоение биомассы).
Хитин является одним из наиболее распространенных органических полимеров в природе, занимая второе (после целлюлозы) место среди полисахаридов [19, 24]. Он представляет собой полимер Р-(1.4)-К-ацетил-Б-глюкозамина, входящий в состав клеточных стенок грибов и покровов беспозвоночных животных. Его содержание может достигать десятых долей процентов от массы почвы [20]. Особого внимания заслуживают огромные количества отходов микробиологических производств на основе грибов, одним из важнейших компонентов которых является хитин [3]. В последнее время активно ведутся работы по изучению хитина и его производных как биосорбентов нефтепродуктов и тяжелых металлов [5, 17]. Бактериальная хитиназа используется в качестве средства защиты растений от возбудителей болезней [15, 16]. В связи с широким применением хитина, актуальным является изучение экологии почвенных хитинолитических микроорганизмов, участвующих в процессе его разложения. Микроорганизмы способны развиваться и функционировать в достаточно широком диапазоне влажности среды и при различных окислительно-восстановительных условиях. Очевидно, что условия обитания оказывают существенное влияние на
хитинолитический комплекс микроорганизмов в
*
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации < МК-4000.2005.4 и грантов РФФИ < 05-04-49252, < 04-04-48346, НШ-8797.2006.4.
почве, а следовательно, на скорость и полноту разложения хитина. Известно, что в сточных водах 90% хитина минерализуется до СО2, в осадках сточных вод наблюдается минерализация лишь 60% этого полисахарида до диоксида углерода [14] (рис. 1). Анаэробные целлюлозолитические бактерии Cellulomonas иёа способны использовать хитин в качестве источника азота [22]. Продукты метаболизма анаэробных хитинолитиков (ацетат, Н2, С02) могут быть субстратом для суль-фатредуцирующих бактерий и метаногенов [23].
Целью работы было изучение активности образования метана и рост микроорганизмов в почвах с добавлением хитина и без него при различных уровнях влажности.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Исследовали образцы гумусовых горизонтов (А1) почв разных типов: чернозема обыкновенного (С орг - 2.9 %, С гк : С фк 2.14; рН водный 6.8), серой лесной (С орг - 1.5%, С гк : С фк - 0.9; рН водный 4.9), каштановой (С орг - 2.0%, С гк : С фк - 1.2, рН водный 7.2), глеетаежной (С орг - 1.5%, С гк : С фк - 0.5; рН водный 4.9) и дерново-подзолистой (С орг -1.1%, С гк : С фк - 1; рН водный 4.5).
Влажность почв и основную их гидрофизическую характеристику определяли методом центрифугирования [11]. Опыт проводили следующим образом. Насыпной образец (контрольный и
Рис. 1. Принципиальная схема разложения хитина (по Бойэру [13]). МГ - метаногены; СР - сульфатредукторы; РОУ -растворимый органический углерод; ХЛ - (1, 2, 3) - хитинолитики.
с хитином) помещали в пальчиковую пластмассовую центрифужную пробирку с отверстиями в дне и латунной сеткой диаметром 0.25 мм, на которую предварительно укладывали кружок фильтровальной бумаги. После помещения образца в пробирку его насыщали водой в течение суток, пробирку герметично закрывали и замещали газовую фазу над почвенным образцом азотом, с целью создания анаэробных условий, после чего инкубировали в течение двух недель для формирования устойчивого хитинолитического комплекса при температуре 25°С. Замену атмосферного воздуха в пробирках над почвенным образцом проводили с помощью продувания азотом каждые пять дней [7]. Насыщенные водой образцы почв (с хитином и контрольный) взвешивали, измеряли их высоту и центрифугировали при скоростях вращения (п) от 100 до 6000 об./мин (время центрифугирования - 2 ч). После каждого этапа центрифугирования измеряли остаточную массу и высоту почвенного образца (к). В конце эксперимента почву количественно переносили в стеклянный бюкс, взвешивали и сушили при 105°С для определения остаточной влажности и массы абсолютно сухой почвы (тх). Расчет влажности %) на этапах центрифугирования и отдельных кинетических стадиях этого процесса осуществляли по формуле:
Ж = [(т - т,)/т,]100,
где т - масса образца на данном этапе центрифугирования, т3 - масса абсолютно сухой почвы. Учитывая влажность почвы, определяли потенциал почвенной влаги, а так же объем и долю пор, занятых водой [1, 10]. Потенциал (давление Р, кПа) почвенной влаги рассчитывали по формуле:
Р = -(0.0055п2Я2со8 а + gksin а),
где п - обороты в минуту (варьируют от 200 до 6000), знак (-) ставится по определению потенциала почвенной влаги, Я - радиус вращения центрифуги (10 см), g - ускорение силы тяжести, к -высота образца, а = 0° - угол между горизонталью и центральной осью симметрии образца.
На всех этапах центрифугирования измеряли интенсивность эмиссии метана методом газовой
хроматографии [7]. В результате получали зависимость микробной трансформации хитина в анаэробных условиях от влажности почвы и от ее порового пространства (пор, занятых азотом, и пор, занятых водой).
Численность бактерий, длину мицелия актино-мицетов и грибов в хитинолитическом комплексе в анаэробных условиях определяли с помощью люминесцентной микроскопии в ходе сукцессии, инициированной увлажнением (до 50% от массы абсолютно сухой почвы) и внесением хитина. Для окрашивания бактерий использовали водный раствор акридина оранжевого (разведение 1 х 10000; 2-4 мин), для грибов - раствор калькофлюора белого (разведение 1 х 10000; 15 мин). Динамику количества микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, в процессе сукцессии, вычисляли по формуле:
М = 4ап х 1010/р,
где М - количество клеток бактерий (кл/г почвы), длина мицелия актиномицетов и грибов (м/г почвы) в 1 г почвы; а - среднее число клеток в поле зрения; р - площадь поля зрения (мкм2); п - показатель разведения [7].
Динамику биомассы бактерий (Бб), мицелия актиномицетов (Бма) и грибов (Бмг) в ходе сукцессии вычисляли по следующим формулам [6]:
Бб = 2М х 102, Бма = 3.9М х 105, Бмг = 0.628М х 4.75 х 103.
Дифференцированный учет микроаэрофиль-ных хитинразлагающих микроорганизов проводили методом посева на плотные питательные среды следующего состава (г/л): коллоидный хитин - 4 КН2Р04 - 0.3; К2НР04 - 0.7; Ме804 ■ 7Н20 - 0.5 Бе804 ■ 7Н20 - 0.01; 2п804 ■ 7Н20 - 0.01; МпС12 ■ 4Н20 - 0.01; агар - 20.
Выделение культур производили на 15-е сутки сукцессии. С целью создания микроаэробных условий поверхность посева заливали еще одним слоем агара (двойной агар).
Идентификацию актиномицетов и бактерий проводили по определителю Берджи [8, 12].
Для выявления спектра актиномицетов, их колонии микроскопировали на чашках с помощью оптического микроскопа (х400), отмечая присутствие воздушного, субстратного мицелия, тип ветвления спороносцев, наличие одиночных, двойных или цепочек спор на воздушном и/или субстратном мицелии, наличие спорангиев. Выделяли несколько морфологических типов, просчитывали число колоний, относящихся к определенному из них, и выделяли в чистую культуру представителей каждого из обозначенных мор-фотипов. Для выделения актиномицетов в чистую культуру и дальнейшего культивирования использовали овсяный и органический агары [4]. Выделенные штаммы нумеровали, и в дальнейшем проводили их идентификацию на основе морфологических и хемотаксономических признаков.
Принадлежность культур к роду Streptomyces предварительно определяли по наличию вегетативных гиф (диаметром 0.5-2.0 мкм), образующих обильно разветвленный воздушный мицелий, редко распадающийся на фрагменты; воздушный мицелий несет цепочки из 3-50 неподвижных спор. Спороносцы прямые или спиральные, располагаются моноподиально или му-товчато. Гидролизаты целых клеток содержат ЬЬ-диаминопимелиновую кислоту (ДАПк) и не содержат дифференцирующих сахаров.
Для видовой идентификации стрептомицетов использовали определитель актиномицетов [4]. Принадлежность выделенных культур стрептомицетов к определенным видам определяли по культурально-морфологическим и физиологическим признакам с использованием следующих дифференцирующих питательных сред: 1) минерального агара I; 2) органического агара II; 3) глицирин-нитратного агара; 4) овсяного агара; 5) среды Треснера [4].
Все пробы почв анализировали в 5-кратной повторности. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы 8ТАТКТ1СА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эмиссия метана наблюдалась из образцов всех исследуемых почв, что свидетельствует о функционировании строгих анаэробов - метаногенов и, следовательно, о наличии анаэробных микро-зон в образцах в ходе всего опыта (рис. 2). В начале эксперимента при полной влагоемкости исследуемых почв эмиссия метана, как и следовало ожидать, была наибольшей, а по мере
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.