ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 2, с. 207-212
УДК 759.873.088.5:661.185
ОБРАЗОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ БАКТЕРИЕЙ Rhodococcus erythropolis sH-5 ПРИ РОСТЕ НА РАЗНЫХ
ИСТОЧНИКАХ УГЛЕРОДА
© 2008 г. И. Н. Гоготов*, Р. С. Ходаков**
*Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московской обл., 142290
e-mail: gogotov@issp.serpukhov.su **Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, Саранск, 430019
Поступила в редакцию 07.09.2006 г.
Показано, что штамм бактерии Rhodococcus erythropolis sH-5 способен к образованию связанных и не связанных с клетками поверхностно-активных веществ (ПАВ), содержание которых зависит от состава среды, природы используемого источника углерода и обеспеченности культуры кислородом. Наибольший выход биоПАВ у R. erythropolis sH-5 был при росте культуры на среде с 2% керосина при нейтральных значениях рН. Установлено, что выход биоПАВ и индекс эмульгирования разных углеводородов зависит от формы используемого бактерией источника азота и возрастает при замене KNO3 на NaNO3. Выход биомассы и биоПАВ у R. erythropolis зависит от температуры культивирования и достигает максимума при 30°С, но не от качества используемой воды (бидистил-лят, католит или анолит). Установлено, что R. capsulatus sH-5 образует больше связанного с клетками биоПАВ, чем его внеклеточной формы.
Поверхностно-активные вещества (ПАВ), образуемые многими микроорганизмами, в последние годы привлекают значительное внимание, что обусловлено возможностями их использования в нефтедобывающей и горнодобывающей промышленности, фармацевтической, химической и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и очистке окружающей среды от разных поллютантов [1-3]. По способности к эмульгированию они не уступают синтетическим ПАВ, но в отличие от них они биоде-градабельны, не токсичны и их можно получать из возобновляемых источников, что важно для разработки новых экологически безопасных технологий. Согласно имеющимся данным, физиологическая роль биологических ПАВ (биоПАВ) микроорганизмов состоит в адгезии к субстрату и эмульгировании питательных компонентов, десорбции с поверхности, рецепторов бактериофагов, антибактериальной и противогрибковой активности [4]. В настоящее время известно 5 групп биоПАВ: гликолипиды, липополисахариды и полисахаридные комплексы, липопептиды, жирные кислоты и нейтральные ли-пиды [1]. Сравнительно недавно нами был выделен из шлама нефтехранилищ Тюменьской нефти штамм нефтеокисляющей бактерии, идентифицированный как Шойососст вгуЛгороШ sH-5 [3].
Цель работы - оптимизация условий образования и выхода биоПАВ бактерией Я. вгуЛгороШ sH-5 при росте на разных источниках углерода.
МЕТОДИКА
Культивирование Rhodococcus erythropolis sH-5.
Бактерию выращивали на жидких минеральных средах (табл. 1). В качестве источника углерода и энергии использовали (%): глюкоза - 1-2, меласса -0.5, сахароза - 1-2, этанол - 1 и алканы (керосин, дизельное топливо) или нефть - 0.5. Источником азота служили NH4NO3 (0.6 г/л) или KNO3 (1.0-1.5 г/л). Для стерилизации н-алканов использовали фильтры MI фирмы ("Gelman, Ann Arbor"), представляющие собой полипропиленовые мембраны с размером пор 0.2 мкм. Культивирование бактерии осуществляли в колбах на качалке (200 об/мин) или миниферментерах на 100 и 500 мл с постоянной продувкой стерильного воздуха (48-168 ч, 30°С), используя в качестве инокулята 2-суточную культуру, выросшую на глюкозо-картофельном агаре. Биомассу определяли по оптической плотности суспензии клеток при 600 нм с последующим пересчетом на сухую массу по калибровочному графику, а также весовым методом.
Измерение поверхностного натяжения (as, мН/м). Измерения проводили на вискозиметре Освальда или методом Дью Нуи на ручном тен-зиометре МТ-6 фирмы "Kruss" (Германия) [2]. Метод Освальда основан на эффекте поднятия жидкости в капилляре. При измерении на нём поверхностного натяжения отмечают разность уровней в капилляре и широкой трубке. Поверхностное натяжение рассчитывают по формуле: a = rphg/2, где: r- радиус капилляра, h - высота подня-
Таблица 1. Состав среды для культивирования R. erythropolis sH-5
Минеральная соль, г/л Субстрат, %
Среда 4 О см 2 Я 4 О см 2 Я св ^ о см 2 Я О 4 я ^ о сп 2 я ¡Z О св £ о 2 я о 4 О со W РМ О 2 Я о 4 О со ад о 2 я 2 d о се и О 2 я 4 о со с я о се £ о г 4 я г о 4 о см Я 2 се £ л о н а т m а ш о к 2 л г ы н и ■е а р а к о '-О Stf & - гексадекан н и с о р е к дизельное топливо рН
№ 1 [15] 2.0 5.0 3.0 0.1 0.01 0.2 0.01 0.002 - - - - - - - - 2.0 -
№ 2 [14] 1.0 10.0 2.5 5.0 0.01 0.2 0.01 0.02 2.0 2.0
№ 3 [8] 6.8 - - - 0.001 0.4 0.1 - 1.0 0.6 - - - - - - - - 6.8-7.0
№ 4 [8] 0.14 - - 1.0 - 0.1 - - - - 1.0 0.6 1.0-2.0 1.0 0.5-1.0 1.0-2.0 - - 6.8-7.0
тия жидкости в капилляре (определяют по разности уровней внешней жидкости и в капилляре).
Анализ способности к эмульгированию. Способность бактерий к эмульгированию определяли по методу Купера [5], используя в качестве субстрата для эмульгирования подсолнечное масло, керосин, дизельное топливо или нефть. Для измерений к 5 мл исследуемого препарата (культуральная жидкость, суспензия клеток или препарат биоПАВ) добавляли 5 мл эмульгируемого субстрата и смесь встряхивали в течение 2 ч. Индекс эмульгирования (Е24) определяли через 24 ч, как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке и выражали в процентах. Супер-натант культуральной жидкости получали путем центрифугирования суспензии выросших клеток (5000 g, 20 мин). Суспензию клеток получали путём суспендирования осадка клеток в дистиллированной воде. Общее содержание биоПАВ (гликолипи-ды) в супернатанте и клетках определяли весовым методом после их экстракции смесью Фолча (хлороформ-метанол в соотношении 2 : 1) с последующим упариванием при 40°С в вакууме [8].
Определение пероксида водорода и электрохимическая активация воды (ЭХА). Для определения Н2О2 в ЭХА водных растворов использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминес-ценции в системе пероксидаза-люминол-н-йодфе-нол [6]. В зависимости от диапазона измеряемых концентраций Н2О2 использовали различные концентрации пероксидазы хрена фирмы "Sigma" (США). Регистрацию хемилюминесценции проводили на жидком сцинтилляционном счетчике для измерения Р-излучения Бета-1 (СССР), работающего в режиме одиночных фотонов. Чувствительность этого метода позволяет определять до 10 пи-комолей Н2О2 при его концентрации менее 1 нМ [6]. Получение ЭХА растворов катодной (католи-та) и анодной (анолита) воды проводили на уста-
новке, описанной в работе [7]. Католит, анолит и контрольную дистиллированную воду хранили в течение всего эксперимента в закрытых пробками стеклянных колбах в холодильнике (+4°С).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Способность микроорганизмов использовать нерастворимые в воде субстраты, обусловлена двумя механизмами - поглощением субстрата в результате прямого взаимодействия клеток с каплями углеводорода и взаимодействием клеток и субстрата при участии биоПАВ [1]. Необходимым условием для прямого контакта клеток с углеводородом является высокая гидрофобность поверхности клеток, в результате которой углеводороды проникают в клетку в виде субмикроскопических капель. При действии второго механизма синтезируемые клеткой биоПАВ эмульгируют гидрофобные субстраты, что облегчает их поступление в клетку. Многие микроорганизмы, способные использовать углеводороды, реализуют оба механизма. Следовательно, для них характерна высокая гидрофобность поверхности клеток и они проявляют способность к синтезу биоПАВ.
Влияние природы используемого источника углерода на образование биоПАВ. Известно, что образование биоПАВ, как и других метаболитов микроорганизмов, зависит от условий выращивания продуцента, в частности от природы и концентрации источников углерода и азота, рН, температуры, фазы роста культуры и других факторов [1, 2]. Проведенные нами исследования показали, что содержание биоПАВ, образуемых Я. вгуЛгороШ 8И-5, варьирует от 0.8 до 4.2 г/л в зависимости от состава среды, природы источника углерода и обеспеченности культуры кислородом (табл. 2). Наиболее низкие значения поверхностного натяжения (а8 = 53-58 мН/м) и индекса эмульгирования
Таблица 2. Влияние источника углерода и скорости перемешивания культуральной среды на образование биоПАВ бактерией Я. втуЛтороШ 8И-5
Среда* Время культивирования, ч Источник углерода н-Алка-ны, 5% Скорость перемешивания, об/мин БиоПАВ, г/л (с продувкой воздуха) БиоПАВ, г/л (с пе-ремеши-ванием) 5, мН/м Индекс эмульгирования, %
керосин дизель нефть керосин дизель нефть без н-алканов керосин* без н-алканов керосин** керосин дизель нефть без н-алканов керосин** керосин дизель нефть
№ 1 72 Сахароза - - - 200 0.75 60 75
72 Керосин - - - 200 1.69 53 65
72 Этанол - - - 200 1.48 61 85
№ 2 168 Сахароза + + + 200 0.88 1.9 н.о. 1.16 54 57 56 н.о. 64 70 72 73
№ 3 168 Глюкоза + + + 200 0.8 2.9 н.о. 2.3 56.5 58 57.5 н.о. 57 69 71 72
№ 4 168 Меласса + + + 200 н.о 4.2 н.о. 3.2 55 57.5 58 н.о. 65 65 69.5 70
* Состав среды см. табл. 1, н.о. - не определяли. ** Выращивание с перемешиванием.
Таблица 3. Влияние концентрации керосина и времени культивирования на выход биоПАВ при выращивании Я. втуШ-тороШ зН-5 на разных средах
рН Индекс эмульгирования, %
Среда Керосин, % Время, ч начальное конечное ПАВ, г/л КЖ исходная КЖ разбавленная
1 : 9 1 : 59
№ 1 1.0 72 6.83 6.59 0.48 64 72 63
144 6.57 0.82 53 60 54
2.0 72 6.50 0.78 58 53 45
144 6.65 1.32 46 44 39
3.0 72 6.40 0.31 48 57 60
144 6.72 0.58 33 45 48
№ 2 1.0 72 6.93 6.78 0.08 55 54 58
144 5.72 0.12 43 43 43
2.0 72 6.32 0.11 59 60 62
144 5.80 0.25 46 43 51
3.0 72 6.61 0.10 57 48 65
144 5.69 0.18 46 36 50
Примечание. Состав сред указан в табл. 1, в качестве субстрата для эмульгирования использовали подсолнечное масло.
Таблица 4. Выход биоПАВ и индекс эмульгирования при выращивании Я. вгythгopolis БИ-5 на средах с разными источниками азота
Концентрация
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.