ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 544-550
УДК 759.873.088.5:661.185
ОБРАЗОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
ПРИ РОСТЕ ШТАММА Rhodococcus erythropolis ЭК-1 НА ГИДРОФИЛЬНЫХ И ГИДРОФОБНЫХ СУБСТРАТАХ
© 2004 г. Т. П. Пирог*, Т. А. Шевчук**, И. Н. Волошина*, Е. В. Карпенко***
*Националъный университет пищевых технологий, Киев, 01033; e-mail tapirog@usuft.kiev.ua **Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 03143 ***Отделение физико-химии и технологии горючих ископаемых Института физической химии НАН
Украины, Лъвов, 79053 Поступила в редакцию 14.11.2003 г.
Изучена способность к образованию поверхностно-активных веществ (ПАВ) при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных (этанол, глюкоза) и гидрофобных (жидкие парафины, гексадекан) субстратах. Установлено, что штамм синтезирует как свободные, так и ассоциированные с клетками ПАВ, обладающие эмульгирующими и поверхностно-активными свойствами. Показана зависимость синтеза ПАВ от состава питательной среды, природы и концентрации углеродного и азотного источников питания, длительности процесса культивирования. По химической природе ПАВ, синтезируемые при росте Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на этаноле, представляют комплекс липидов с соединениями полисахаридно-белковой природы. В составе липидов выявлены гликолипиды (трегалозомоно- и трегалозодикориномиколаты) и общие липиды (цетиловый спирт, пальмитиновая кислота, метиловый эфир н-пентадекановой кислоты, триглицерид, миколовые кислоты).
В течение последних 20-30 лет микробные поверхностно-активные вещества являются объектом интенсивных теоретических и прикладных исследований, что обусловлено их возможным практическим использованием в нефте- и горнодобывающей, химической, фармацевтической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, а также для очистки окружающей среды. Микробные ПАВ по своей эффективности не уступают синтетическим, а такое их преимущество, как биодеградабельность и нетоксичность делает их особенно перспективными для создания новых экологически безопасных технологий.
Из загрязненных нефтью образцов почвы и воды нами были выделены нефтеокисляющие бактерии, идентифицированные как Acinetobacter calcoaceticus K-4, Nocardia vaceinii K-8, Rhodococcus erythropolis ЭК-1, Mycobacterium sp. K-2 [1]. Установлена возможность очистки воды от нефти (100 мг/л) иммобилизованными на керамзите клетками R. erythropolis ЭК-1 и N. vaceinii K-8. Показана зависимость степени очистки воды от скорости ее подачи, уровня аэрации и источников азота и фосфора. Эффективность очистки воды от нефти иммобилизованными клетками R. erythropolis ЭК-1 при высокой скорости протока (до 0.68 л/ч), низкой аэрации (до 0.1 л/л в мин) и периодической подаче 0.01% диаммонийфосфата составляла 99.5-99.8%.
Известно, что способность к ассимиляции углеводородных субстратов у микроорганизмов часто обусловлена синтезом ПАВ [2-6].
Цель работы - изучение образования поверхностно-активных веществ штаммом Rhodococcus erythropolis ЭК-1; исследование синтеза ПАВ при культивировании R. erythropolis ЭК-1 на гидрофобных и гидрофильных субстратах; изучение некоторых физико-химических свойств ПАВ, возможности повышения синтеза ПАВ штаммом R. erythropolis ЭК-1.
МЕТОДИКА
Культивирование ЯНойососст егуЬНтороИъ ЭК-1. Бактерии выращивали на жидких минеральных средах следующего состава (г/л): Среда А: КН2Р04 - 6.8; №0Н - 1.0; 1ЧН4Ш3 - 0.6; М§Б04 ■ ■ 7Н20 - 0.4; СаС12 ■ 2Н20 - 0.1; Бе804 ■ 7Н20 -0.001, рН 6.8-7.0. Среда Б: КШ3 - 1.0; КаС1 - 1.0; №2НР04 - 0.6; КН2Р04 - 0.14; М§Б04 ■ 7Н20 - 0.1, рН 6.8-7.0. В качестве источника углерода и энергии использовали этанол в концентрации 1 и 2% (по объему); жидкие парафины (н-алканы С10-С16) -0.5 и 1% (по объему); гексадекан - 1 и 2% (по объему), а также глюкозу - 1%. В одном из вариантов 1ЧН4Ш3 в среде А был заменен на КК03 (1.0 и 1.5 г/л).
Культивирование бактерий осуществляли в колбах на качалке (220 об/мин) при 30°С в течение 48-168 ч. В качестве посевного материала использовали 2-суточную культуру, выращенную на глюкозо-картофельном агаре.
Биомассу определяли по оптической плотности клеточной суспензии с последующим пересчетом на сухую массу клеток по калибровочному графику, а также весовым методом.
Определение показателей синтеза ПАВ. Способность к синтезу ПАВ оценивали по следующим показателям.
1. Поверхностное натяжение (а.) свободной от клеток культуральной жидкости, которое измеряли с помощью платиновой и стеклянной пластинки по методу Вильгельми [7]. Значение а. является качественным показателем, свидетельствующим о наличии ПАВ в культуральной жидкости.
2. Экспресс-оценка количественного содержания ПАВ в культуральной жидкости использовали показатель условной концентрации (в тексте как ПАВ*). Показатель определяется как степень разведения свободной от клеток культуральной жидкости в точке падения поверхностного натяжения на кривой зависимости а. от значения разведения. Абсцисса точки перегиба кривой соответствует значению условной концентрации ПАВ* и выражается в безразмерных единицах. Использование такого приема для определения содержания ПАВ в культуральной жидкости описано в работе [8].
3. Эмульгирующая активность, которую определяли по методу, описанному в работе [9]. В качестве субстратов для эмульгирования использовали вазелиновое масло, подсолнечное масло, легкую нефть (плотность 0.80 г/см3) и гексадекан. К 5 мл исследуемого раствора, содержащего ПАВ (культу-ральная жидкость, супернатант культуральной жидкости, клеточная суспензия), добавляли 5 мл эмульгируемого субстрата и встряхивали в течение 2 мин. Измерение индекса эмульгирования (Е24) определяли через 24 ч как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке и выражали в процентах. Для получения супернатанта культуральной жидкости ее центрифугировали при 5000 § в течение 20 мин. Клеточную суспензию получали при сус-пендировании осадка клеток в дистиллированной воде, объем которой был равен объему исходной культуральной жидкости, из которой были осаждены клетки.
4. Нефтеотмывающие свойства культуральной жидкости, супернатанта культуральной жидкости и клеточной суспензии. Для оценки нефтеотмываю-щих свойств на стеклянную пластинку (4 х 2 см) наносили тонкий слой тяжелой нефти (плотность 0.99 г/см3), стеклянную пластинку опускали на 1 ч в исследуемый раствор, содержащий ПАВ, после
чего определяли площадь чистой, отмытой от нефти, поверхности стекла. Нефтеотмывающие свойства рассчитывали как отношение площади отмытого от нефти стекла к общей площади и выражали в процентах.
5. Содержание углеводов в культуральной жидкости, которое анализировали по реакции с фенолом и серной кислотой [10]. Выбор этого показателя для количественного определения ПАВ был обусловлен тем, что, согласно данным литературы, родококки синтезируют гликолипиды, в частности трегалозолипиды [2-4].
6. Содержание общих липидов в культуральной жидкости, которое определяли весовым методом после экстракции смесью Фолча (хлороформ-метанол 2 : 1), с последующим упариванием растворителя в вакууме (40°C).
Определение химического состава липидов. Липиды экстрагировали из культуральной жидкости, супернатанта культуральной жидкости и клеточной суспензии смесью хлороформ-метанол (2 : 1). Качественный анализ липидов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках DC-Alufolien Kieselgel 60 ("Merck", Германия) в системах растворителей: полярная система -хлороформ-метанол-вода (85 : 15 : 1); неполярная система I - гексан-диэтиловый эфир (2 : 1); неполярная система II - гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (90 : 10 : 1).
Идентификацию липидов осуществляли путем окрашивания пластинок спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и парами йода (общие липиды), раствором нингидрина (пепти-долипиды), анисовым альдегидом и антроновым реактивом (гликолипиды) [11].
Химический состав внеклеточных ПАВ. Внеклеточные ПАВ выделяли следующим образом. Культуральную жидкость центрифугировали (5000 g, 20 мин) для отделения клеток родокок-ков. Полученный супернатант диализовали против дистиллированной воды в течение 3 сут, затем концентрировали в вакууме (40°C). В полученном концентрате анализировали содержание нейтральных моносахаридов, уроновых кислот, суммарного белка и жирных кислот.
Для анализа нейтральных моносахаридов и уроновых кислот концентрат гидролизовали в запаянных ампулах с 2 н. трифторуксусной кислотой в течение 2.5 ч при 121°С. Содержание нейтральных моносахаридов и уроновых кислот с помощью углеводного анализатора "Biotronik LC-2000", Германия (колонка 0.38 х 12.5 см; смола Dionex Ax8-II) в 0.5 М Na-боратном буфере, рН 8.0, при 60°С и 0.04 М фосфатном буфере, рН 2.4, при 70°С соответственно, детектировали при 570 нм после реакции с 2.21-бицинхолинатом меди.
Суммарный белок определяли на аминокислотном анализаторе "Biotronik LC-2000", Герма-
Таблица 1. Влияние условий культивирования на синтез ПАВ штаммом ЯНойососсш вгуЛгороШ ЭК-1
Источник углерода Концентрация источника углерода, % Время роста, ч Среда РНконечное Биомасса, г/л Углеводы, г/л ПАВ* Индекс эмульгирования, %
Этанол 1.0 48 А 6.3 0.80 0.50 н.о. н.о.
Б 7.8 0.56 0.40 н.о. н.о.
1.0 96 А 5.5 1.30 0.90 1.1 70
Б 4.5 0.85 0.70 1.1 67
2.0 96 А 5.3 2.00 0.86 1.2 88
Б 4.8 1.90 0.70 1.2 75
Жидкие 0.5 96 А 6.5 0.62 0.48 н.о. 29
парафины Б 7.9 0.40 0.16 н.о. 32
1.0 96 А 6.5 2.05 0.60 1.5 23
Б 7.9 1.65 0.32 1.4 22
1.0 120 А 6.1 1.80 1.05 2.7 31
Б 7.7 1.55 0.63 2.5 26
Гексадекан 1.0 120 А 5.7 1.60 1.00 4.4 50
Б 6.7 1.50 1.08 5.4 54
2.0 120 А 5.8 1.90 1.35 4.3 54
Б 6.6 1.85 1.23 4.2 56
2.0 168 А 5.6 1.70 1.65 5.2 50
Б 6.7 1.60 1.60 6.0 53
Глюкоза 1.0 120 А 6.7 0.95 0.70 1.1 69
Б 7.4 1.40 0.63 1.1 68
Примечания: в качестве субстрата для эмульгирования использовали вазелиновое масло; н.о. - не определяли.
ния (колонка 0.4 х 22 см; смола Ostion LG AN) в Na-боратно-цитратном буфере при 80°С после гидролиза 4 н. HCl (16 ч, 100°С). Детектировали при 570 нм после реакции с нингидр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.