ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 4, с. 395-401
УДК 577.332.23:539.199
ОБЩАЯ ПЕРОКСИДАЗНАЯ И КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТИ СВЕТЯЩИХСЯ БАЗИДИОМИЦЕТОВ Armillaria borealis И Neonothopanus nambi В СРАВНЕНИИ С УРОВНЕМ СВЕТОВОЙ ЭМИССИИ
© 2015 г. О. А. Могильная, Н. О. Ронжин, С. Е. Медведева, В. С. Бондарь
Институт биофизики СО РАН, Красноярск, 660036 e-mail: ol_mog@mail.ru Поступила в редакцию 25.11.2014 г.
Проведено сравнение пероксидазной и каталазной активностей мицелия светящихся базидиомице-тов Armillaria borealis и Neonothopanus nambi в нормальных и в стрессовых условиях. В условиях стресса наблюдали повышение уровня свечения, а также увеличение активности пероксидазы и катала-зы. При этом в экстрактах мицелия A. borealis активность пероксидазы оказалась почти на полтора порядка ниже, а каталазы — более чем на два порядка выше по сравнению с мицелием N. nambi. Можно предположить, что различие между яркосветящимся и тусклым мицелием N. nambi определяется содержанием H2O2 или других перекисных соединений.
Ключевые слова: базидиомицеты, люминесценция, пероксидаза, каталаза. DOI: 10.7868/S055510991504011X
Люминесцентные системы многих живых организмов в настоящее время хорошо изучены, из этих организмов выделены и охарактеризованы ферменты, катализирующие реакции излучения света (люциферазы) и их субстраты (люцифери-ны) [1]. Однако на протяжении уже более ста лет механизмы испускания света высшими грибами, базидиомицетами, остаются загадкой для исследователей, работающих в этой области. До настоящего времени не расшифрованы как молекулярная организация люминесцентной системы высших грибов, так и механизм реакции светоизлучения. Прежде всего, не определены фермент (или ферментный комплекс), выполняющий в грибах функцию люциферазы, и структура субстрата реакции свечения — люциферина. В середине прошлого века в экспериментах с экстрактами грибов было показано, что в реакции излучения участвуют два термолабильных белковых компонента — растворимая НАД(Ф)Н-зави-симая редуктаза и люцифераза, представляющая собой нерастворимые частицы, термостабильный люциферин и НАД(Ф)Н [2—4]. Позднее этот результат был подтвержден двумя другими группами исследователей [5—8]. Однако до настоящего времени структура и свойства люциферазы, НАД(Ф)Н-зависимой редуктазы и люциферина грибов неизвестны, поскольку эти компоненты до сих пор не получены в чистом виде.
Ранее предполагали, что в механизме люминесценции высших грибов участвуют активные формы кислорода (АФК) и ферменты с оксидаз-ной функцией [1, 9, 10]. Результаты изучения све-
тящегося базидиомицета ИеопоЛорапт патЫ также свидетельствуют об участии АФК и окси-дазных ферментов в механизме свечения грибов [11—13]. В этих работах было показано, что добавление к образцам мицелия гриба пероксида водорода в милимолярных концентрациях стимулирует их свечение. Аналогичное действие Н2О2 было продемонстрировано и при работе со светящимися экстрактами, полученными из мицелия N. патЫ и содержащими люминесцентную систему этого гриба [14]. Однако не было показано стимуляции свечения мицелия базидиомицета ЛгтШапа Ьоге-аШ под влиянием пероксида водорода.
Известно, что АФК, в том числе и Н202, постоянно образуются в клетке, но в норме их уровень невелик, и клетка инактивирует их с помощью антиоксидантной системы [15]. Высшие грибы обладают значительным набором ферментов, участвующих в метаболизме АФК, и в первую очередь, это супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы [16—18]. Пероксидазы грибов могут быть секретируемыми, цитозольными, микросо-мальными, или локализованными в органеллах клетки. Большая часть из них является гемсодер-жащими ферментами. Гемсодержащие перокси-дазы базидиомицетов достаточно подробно изучены [19—26]. Они играют важную роль в жизнедеятельности грибов и представляют интерес для биотехнологического применения. Каталазы охарактеризованы, в основном, у низших грибов и аскомицетов [27—28]. Показано, что эти ферменты функционируют вне или внутри клетки и про-
395
3*
являют наивысшую каталитическую активность при высоких концентрациях H2O2.
Стимулировать образование АФК в биологических объектах можно путем воздействия физических, химических и биологических факторов [15]. При исследовании базидиомицета N. nambi было установлено, что действие таких стрессовых факторов, как механическое повреждение светящегося мицелия или его инкубация в деионизованной воде, вызывало многократное усиление световой эмиссии гриба [11—13]. При регулярной смене воды высокий уровень светопродукции сохранялся в течение нескольких суток и более. В то же время аналогичные воздействия на светящийся мицелий гриба A. borealis сопровождались значительно меньшим эффектом стимуляции свечения [29]. Таким образом, длительное свечение мицелия грибов может послужить основой для создания нового класса биолюминесцентных сенсоров.
Изложенные выше факты позволяют предположить взаимосвязь между свечением высших грибов, в механизме которого могут принимать участие АФК, и активностью ферментов, участвующих в их метаболизме.
Цель работы — исследование общей перокси-дазной и каталазной активностей мицелия бази-диомицетов A. borealis и N. nambi в сравнении с изменением их свечения в стрессовых условиях.
МЕТОДИКА
Культуры. В работе использованы культуры двух видов светящихся высших грибов, обитающих в разных климатических зонах (коллекция микроорганизмов Института биофизики СО РАН, ИБСО). Культура гриба N. nambi (ИБСО 2307), произрастающего в тропических лесах южного Вьетнама [30], предоставлена компанией "Bio-lumi" (Вьетнам). Культура гриба A. borealis (ИБСО 2328) выделена из плодового тела опенка, произрастающего в окрестных лесах города Красноярска (Россия).
Методы. Глубинное выращивание мицелия N. nambi проводили в жидкой питательной карто-фельно-сахарозной среде (200 г картофеля и 20 г сахарозы, 1 л дистиллированной воды) в конических колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды. Для выращивания мицелия A. borealis использовали коммерческую среду PDB ("HiMedia Laboratories", Индия). В качестве инокулята использовали суспензии измельченного мицелия изучаемых видов грибов, который предварительно выращивали 8—10 сут в чашках Петри на указанных для каждого гриба питательных средах с добавлением 15 г агар-агара/1 л дистиллированной воды. Объем посевного материала составлял 2—5% от объема питательной среды. Мицелий N. nambi выращивали в течение 3—5 сут при 26—28°C, а A. borealis - 10-14 сут при 22-23°C. Культивирование проводили при постоянном пере-
мешивании со скоростью 180-200 об./мин на шей-кере-инкубаторе ES-20 ("Biosan", Латвия). Такой способ культивирования позволял получать грибной мицелий в виде отдельных шарообразных глобул (пеллет). После завершения культивирования глобулы извлекали из питательной среды и инкубировали в деионизованной воде в течение нескольких суток при периодическом мягком перемешивании.
Уровень свечения глобул измеряли на люми-нометре Glomax 20/20 ("Promega", США), калиброванном по радиоактивному стандарту Га-стингса-Вебера [31] (одна люминесцентная единица составляла 2.7 х 103 фотонов в секунду). Для определения сухой массы глобулы после измерения свечения высушивали в роторном вакуумном концентраторе Сoncentrator 5301 ("Eppendorf", Германия) в течение 1.5 ч при 30°C. Величину удельной люминесцентной активности мицелия рассчитывали как отношение интенсивности его световой эмиссии к сухой биомассе.
Визуализацию свечения глобул проводили с использованием ChemiDoc™ XRS + System ("BioRad", США) в темноте в режиме накопления сигнала. Экспозиция подбиралась экспериментально и составляла 100 или 300 с
Активность пероксидазы мицелия оценивали с помощью реакции окислительного азосочетания [32]. Для определения пероксидазной активности в нативных глобулах 3 глобулы одинакового размера помещали в пробирки с 1 мл деионизованной воды, содержащей 0.56 мг/мл фенола и 0.1 мг/мл 4-аминоантипирина (4-АА), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Окрашенный раствор отбирали и измеряли оптическую плотность образовавшегося в результате реакции окрашенного продукта (хинонимина) на спектрофотометре UV-1800 ("Shimadzu", Япония) при 506 нм.
Для определения общей пероксидазной активности в экстрактах мицелия глобулы разрушали ультразвуком, используя дезинтегратор УЗТА 0.63/22-ОМ ("ООО Центр ультразвуковых технологий", Россия). Глобулы помещали в 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6.9, в соотношении 1 : 1.5 (вес сырой биомассы:объем буфера). Ультразвуковую обработку проводили на льду при мощности 97 ватт несколько раз по 2-3 с (интервал 1 мин). Разрушенную биомассу центрифугировали при 16000 g в течение 20 мин при 4°C в центрифуге 5415 R ("Eppendorf", Германия). Супернатанты отбирали и замораживали при -20°C. Замороженные образцы оттаивали при комнатной температуре и повторно центрифугировали в тех же условиях. В полученных супернатантах определяли пероксидазную активность с помощью реакции окислительного азосочетания.
Рис. 1. Микроскопическое изображение гладких и шероховатых глобул N. патЫ (а, б — край шероховатой глобулы) и глобулы Л. ЬогеаШ с массивной пигментированной сердцевиной и перекрученными пучками гиф на поверхности (в). Масштабная линейка: 10 мм (а) и 100 мкм (б, в).
Реакционная смесь содержала 980 мкл супер-натанта, 10 мкл 4-АА (0.1 мг/мл) и 10 мкл фенола (0.56 мг/мл). Через 60 мин инкубации оценивали образование окрашенного продукта реакции по величине оптической плотности при 506 нм на спектрофотометре UV-1800. Удельную перокси-дазную активность супернатантов рассчитывали как отношение оптической плотности при 506 нм к суммарному содержанию белка.
Содержание белка в супернатантах определяли с биуретовым реактивом [33], используя БСА в качестве стандарта.
Активность каталазы в экстрактах, полученных выше описанным способом, оценивали прямым спектрофотометрическим методом (www.sig-maaldrich.com), позволяющим определить снижение оптической плотности образца при 240 нм после добавления к экстрактам H2O2. За одну единицу активности принимали количество фермента, н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.