МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 491-499
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.217.34
ОБЩИЕ ЧЕРТЫ В ОРГАНИЗАЦИИ УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ РИБОСОМНОГО БЕЛКА S26e НА КОДИРУЮЩЕЙ ЕГО пре-мРНК И 18S рРНК © 2014 г. А. В. Иванов, А. А. Малыгин, Г. Г. Карпова*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 19.11.2013 г.
Принята к печати 19.12.2013 г.
Известно, что рибосомный белок (rp) S26e человека способен связываться с первым интроном своей пре-мРНК и тем самым ингибировать ее сплайсинг. В настоящей работе с помощью гидроксил-ради-кального футпринтинга проведено детальное картирование участка связывания rpS26e на РНК-транскрипте, соответствующем фрагменту его пре-мРНК, который содержит первый интрон, фланкированный первым экзоном и частью второго экзона. Определены нуклеотиды РНК, защищаемые от атаки гидроксил-радикалами в присутствии rpS26e. Большинство из них обнаружено в районе З'-сайта сплайсинга первого интрона в пурин-богатой последовательности, которая в рассчитанной вторичной структуре пре-мРНК rpS26e образует петлю, соединяющую две спирали, а остальные нуклеотиды расположены вблизи 5'-сайта сплайсинга. При сравнении участков связывания rpS26e на вторичных структурах пре-мРНК и 18S рРНК выявлены элементы сходства в организации этих участков. Оказалось, что оба участка содержат структурный мотив, представленный протяженной пурин-богатой петлей между двумя спиралями, который мог бы узнавать rpS26e при связывании с этими РНК. Полученные данные проливают свет на структурные аспекты РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе авторегуляции экспрессии гена RPS26 человека на уровне сплайсинга.
Ключевые слова: рибосомный белок S26e человека, пре-мРНК S26e, гидроксил-радикальный футприн-тинг, РНК-белковые взаимодействия, 5'- и З'-сайты сплайсинга.
COMMON FEATURES IN ARRANGEMENTS OF RIBOSOMAL PROTEIN S26e BINDING SITES ON ITS OWN pre-mRNA AND THE 18S rRNA, by A. V. Ivanov, A. A. Malygin, G. G. Karpova* (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: karpova@niboch.nsc.ru). It is known that human ribosomal protein (rp) S26e can bind to the first intron of its own pre-mRNA and thereby inhibit its splicing. In this work, hydroxyl radical footprint-ing was applied for detailed mapping of the rpS26e binding site on an RNA transcript corresponding to the rpS26e pre-mRNA fragment containing the first intron flanked by the first exon and a part of the second exon sequences. Nucleotides of this RNA protected from hydroxyl radical attack in the presence of rpS26e were identified. Most of them are found in the region of the З'-splice site of the first intron within a purine-rich sequence, which forms a loop connecting two helices in the predicted secondary structure of the rpS26e pre-mRNA fragment, and the remaining nucleotides are located near the 5'-splice site. Comparison of arrangements of rpS26e binding sites on the pre-mRNA and 18S rRNA secondary structures reveals similar elements in the organization of these sites. It was found that both sites contain a structural motif, represented by an extended purine-rich loop between two helices, which could be recognized by rpS26e upon binding to these RNAs. The data obtained shed light on the structural aspects of RNA-protein interactions underlying autoregulation of human RPS26e gene expression at the splicing step.
Keywords: human ribosomal protein S26e, pre-mRNA of ribosomal protein S26e, hydroxyl radical footprint-ing, RNA-protein interaction, 5'- and З'-sites of splicing.
DOI: 10.7868/S0026898414030082
Принятые сокращения: гр826е — рибосомный белок 826 человека; ЕВТА — этилендиаминтетрауксусная кислота; ПААГ — полиакриламидный гель; ВТТ — дитиотреитол; ВМ8 — диметилсульфат; 8В8 — додецилсульфат натрия; ОТР — гуанозин-трифосфат.
* Эл. почта: karpova@niboch.nsc.ru
Рибосомные белки эукариот образуют большую группу белков (до 80 у млекопитающих) различной структуры, которые являются компонентами субчастиц рибосом. Большинство рибосом-ных белков несет высокий положительный заряд, благодаря чему они обладают высоким сродством к РНК и могут взаимодействовать не только с их "каноническими" партнерами — рРНК, но также с РНК других видов, например, с пре-мРНК [1, 2], мРНК [3] и геномными РНК вирусов [4, 5].
Связывание рибосомных белков с нерибосом-ными РНК часто имеет регуляторный характер — посредством такого связывания рибосомные белки вовлекаются в регуляцию различных клеточных процессов, протекающих с участием этих РНК [6]. В качестве одного из наиболее ярких примеров можно привести участие рибосомных белков в контроле экспрессии собственных генов на стадии сплайсинга через связывание с их пре-мРНК [2, 6]. Регуляция на этой стадии происходит по принципу обратной связи, когда повышение количества рибосомного белка в клетке может приводить либо к ингибированию сплайсинга его пре-мРНК (см., например [7, 8]), либо к стимулированию альтернативного сплайсинга с последующей быстрой деградацией образующегося продукта [9, 10]. Молекулярные механизмы такого способа регуляции биосинтеза рибосом-ных белков изучены слабо. Но структурно-функциональные исследования, выполненные с рядом рибосомных белков [8, 11—14], показали, что они могут связываться с собственными пре-мРНК в области 5'- и/или З'-сайтов сплайсинга первого интрона и таким образом ингибировать его вырезание.
Охарактеризованы структуры участков связывания только двух эукариотических рибосомных белков на кодирующих их пре-мРНК, а именно, гр814е [11] и более детально грЬЗОе Басскаготусез сегеу1з1ае [14—16]. При связывании с собственными пре-мРНК оба эти белка узнавали характерные структурные элементы, расположенные вблизи 5'-сайта сплайсинга первого интрона, которые присутствуют также в участках связывания этих белков на 188 рРНК. Другими словами, в основе распознавания, по крайней мере этими рибосомными белками, своих участков связывания на пре-мРНК и рРНК лежит принцип структурной мимикрии.
Реализуется ли принцип структурной мимикрии при распознавании рибосомными белками высших эукариот своих участков связывания на РНК? Чтобы узнать это, мы определили структуру участка связывания гр826е человека на фрагменте кодирующей его пре-мРНК, содержащем первый экзон, первый интрон и часть второго эк-зона, с помощью химического футпринтинга с использованием гидроксил-радикалов. Сравни-
вая данные по химическому зондированию структуры этого фрагмента пре-мРНК в комплексе с rpS26e со структурой участка 18S рРНК, с которым связывается rpS26e в составе рибосомы человека, мы выявили общие черты в организации участков связывания rpS26e на этих РНК.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали акриламид, ^№-мети-лен-бис-акриламид ("Applichem"), ингибитор ри-бонуклеаз — РНКазин ("Promega"), Taq-ДНК-по-лимеразу ("СибЭнзим", Новосибирск) и обратную транскриптазу AMV ("New England Biolabs"). Олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы в Лаборатории медицинской химии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН). [a-32P]GTP (1000 Ки/ммоль) синтезирован в Лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН. РНК-полиме-раза фага Т7 (450000 ед. акт./мг) любезно предоставлена I. Eperon (Лестерский университет, Великобритания). Рекомбинантный rpS26e и ДНК-матрицу для фрагмента пре-мРНК rpS26e получали согласно [17, 18].
Синтез РНК-транскрипта. Меченную 32P РНК, соответствующую фрагменту пре-мРНК rpS26e, который содержит первый интрон, фланкированный первым экзоном и частью второго экзона, и включает нуклеотиды 1—345 данной пре-мРНК (РНК1-345), получали с помощью Т7-транскрип-ции в соответствии c [19]. В качестве радиоактивно меченного рибонуклеозидтрифосфата использовали [a-32P]GTP. Немеченую РНК1_345 получали согласно [17]. Меченую РНК выделяли с помощью электрофореза в 5%-ном денатурирующем ПААГ, немеченую — с помощью гель-фильтрации на колонке со смолой Sephadex G-75. После выделения РНК осаждали этиловым спиртом и растворяли в деионизованной воде.
Связывание меченной 32P РНК1-345 с rpS26e
проводили в буферном растворе А (20 мМ буфер HEPES-KOH, pH 7.5, содержащий 300 мМ Ка, 2мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0.05% Triton X-100 и 0.5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) в течение 15 мин при 20OC; РНК предварительно выдерживали в этом же буфере в течение 10 мин при 37OC, а затем охлаждали до 20OC. Концентрацию белков в реакционной смеси изменяли от 1 нМ до 0.1 мкМ, концентрация РНК составляла 5—10 пМ. Степень связывания РНК с белками определяли по сорбции комплексов на нитроцел-люлозных фильтрах как описано в [12]. Радиоактивность, сорбированную на фильтрах, просчитывали на приборе "Molecular Imager FX Pro" ("Bio-Rad", США). Кажущуюся константу ассоциации (Ка) РНК1-345 с rpS26e определяли с помощью программы SigmaPlot 9.0.
□—С
Ген RPS26e ]-[
РНК
1-345
экзон интрон
^TCCTCTCTCCGGTCCGTGCCTCCAAGATSqtqaqtctfcc ttgcgtgg tga ggg tggggg t tcgggtgcagac tc tgggat tg tggggaag tgagagcc tggagcacggctgagggg tggac ::ga g tg taca tt teat ttgc tc tggggg tcggcgggat ttgcggagaaacaggaga tccga Ijcggcgcc ttcc tggaggctgccggtgcggct tg tggccggaaagggactgaggctgggtg jgttgegecgttttcetaaeagttttcecatcctgtcjeaоacaaagaaaagaaggaacra rGGTCGTGCCAAAAAGGGCCGCGGCCACGTGCAGCCTATT
Н Р
«
О «
св
в
m
св
з
«
m U
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
1 x 10
1 x 10-[rpS26e], M
1 x 10-
а
Рис. 1. Характеристика фрагмента пре-мРНК гр826е (РНК1_345), использованного в настоящей работе. а — Схематическое представление экзон-интронной структуры гена ЯР826в человека и нуклеотидная последовательность РНК^_345. Подчеркнуты 5'- и З'-сайты сплайсинга первого интрона. Последовательности экзонов обозначены прописными буквами, интрон выделен строчными буквами. Нуклеотиды, защищаемые от атаки гидроксил-радикалами в присутствии гр826е, выделены серым. б — Типичная изотерма адсорбции гр826е на РНК^_345, построенная по результатам трех независимых опыт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.