ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 6, с. 685-693
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.21
ОБУЧЕНИЕ И ФОРМИРОВАНИЕ ПАМЯТИ В СОПОСТАВЛЕНИИ С РАСПРЕДЕЛЕНИЕМ pCREB И БЕЛКОВЫХ АГРЕГАТОВ В НЕЙРОМЫШЕЧНЫХ КОНТАКТАХ У Drosophila melanogaster ПРИ ПОЛИМОРФИЗМЕ limkl
© 2015 г. А. Н. Каминская1, 2, 3, Е. А. Никитина3, 4, А. В. Медведева2, 3, М. С. Герасименко4,
Д. А. Черникова4, Е. В. Савватеева-Попова2, 3
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук,
Санкт-Петербург 194223 e-mail: kaminskayaan@mail.ru 2Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и биотехнологии,
Санкт-Петербург 199034 e-mail: esavvateeva@mail.ru 3Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034 4Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, кафедра зоологии,
Санкт-Петербург 191186 Поступила в редакцию 03.06.2014 г.
Как показано нами ранее, полиморфизм по гену limk1 дрозофилы сказывается на содержании его
продукта и приводит к нарушениям поведения ухаживания, звукопродукции и обучения. Результате? ч
ты настоящего исследования трех линии дикого типа и мутанта agn с измененной структурой гена limk1 показывают, что у линий Canton-S и Oregon-R долгосрочная память формируется, у Berlin нарушена, у agnts3 практически отсутствует. Этот температурочувствительный мутант, несущий рядом с 3'-UTR dlimk1 инсерцию S-элемента семейства Tc1/mariner, проявляет диаметрально противоположное наблюдаемому у Canton-S распределение транскрипционного фактора pCREB в области нейромышечных контактов (НМК) II дорзального нерва имаго до и после обучения. Кроме того, только у agnts3 в той же области присутствуют амилоидные включения, что, вероятно, затрудняет транспорт pCREB, тем самым предотвращая формирование краткосрочной и долгосрочной памяти.
DOI: 10.7868/S0016675815060077
Одним из ключевых каскадов, обеспечивающих нейрональную пластичность при обучении, является каскад ремоделирования актинового ци-тоскелета. Основным регулятором ремоделирования актина является фермент ЫМ-киназа 1 (ЦМК1) [1]. Данный фермент, фосфорилируя ко-филин, блокирует деполимеризацию актина [2], что вызывает перестройку шипиков дендритов, обеспечивая этим синаптическую пластичность. Межнейрональная коммуникация нарушается при гиперактивации кофилина, основного субстрата ЫМК1, за счет образования кофилин-акти-новых комплексов, которые накапливаются в аксонах и дендритах нейронов, блокируя везикулярный транспорт, и являются причиной атрофии нейритов [3]. Атрофия нейритов выявляется на ранних стадиях деменции и характеризуется потерей краткосрочной памяти [4, 5]. Синаптическая дисфункция напрямую коррелирует с нарушениями когнитивных функций у пациентов с болезнью Альцгеймера [6]. Образование актин-кофилино-
вых комплексов при снижении уровня экспрессии LIMK1 регистрируется вокруг агрегатов р-амило-ида [7]. Накопление амилоида р интерферирует с активностью CREB. Фосфорилированная форма CREB является транскрипционным фактором, необходимым для активации транскрипции ряда генов, таких как c-fos, zif/268, somatostatin и BDNF[8], участвующих в консолидации памяти [9]. LIMK1 фосфорилирует CREB напрямую и опосредованно [10], поэтому содержание pCREB в аксонах очень значимо для преобразования экстраклеточных сигналов, и pCREB можно рассматривать в качестве маркера активности LIMK1 в нейритах, оценивая вклад полиморфизма LIMK1 в обеспечение нейрональной пластичности при обучении.
Одним из наиболее удобных модельных объектов для изучения механизмов нейрональной пластичности является Drosophila melanogaster [11]. Нервные сети насекомых устроены существенно проще, чем у млекопитающих, но обладают сходными функциональными возможностями. Их ра-
бота основана на использовании общих молекулярных компонентов, кодируемых гомологичными генами, — параллелизм функций по М.Е. Лобашеву и Л.А. Орбели [12].
Молекулярные процессы, обеспечивающие пластичность в области нейромышечных контактов (НМК), могут служить моделью аналогичных процессов, обеспечивающих нейрональную пластичность при обучении. Синаптическая пластичность в области НМК необходима для синхронизации сокращений мышечных волокон при выполнении двигательных актов. Генерация самцом звуковых сигналов ухаживания обеспечивается функционированием II дорзального нерва, иннервирующего мышцы крыла. Регистрация этих сигналов аналогична записи электромио-грамм у человека, позволяющая выявлять локомоторные нарушения как ранний признак нейро-дегенеративных заболеваний.
Ранее нами было показано, как измененная структура гена limk1 сказывается на содержании его продукта и как это реализуется на уровне поведения ухаживания, звукопродукции и обучения [13]. Однако неизвестно, какие изменения в области НМК сопровождают характерные особенности условно-рефлекторной деятельности у линий дрозофилы, полиморфных по гену limk1. В связи с этим целью настоящего исследования стало изучение влияния полиморфизма LIMK1 на обучение и формирование памяти самцов четырех линий дрозофилы в сопоставлении с распределением транскрипционного фактора pCREB и белковых агрегатов в области НМК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали линии дрозофилы, полиморфные по гену limk1, обнаруженному в локу-се agnostic (Х-хромосома, 11B):
1) Canton-S — контрольная линия дикого типа;
2) Berlin — выделена из дикой популяции г. Берлина. У этой линии при ПЦР-картировании гена limk1 обнаружено отсутствие ПЦР-фрагмен-тов в области 3, 4 и частично 5-го экзонов, а также 2, 3 и 4-го интронов [14];
3) Oregon-R — линия из дикой популяции штата Орегон, США. При ПЦР-картировании гена limk1 у данной линии наблюдалось отсутствие ПЦР-фрагментов в области 2-го экзона, 1-го и 2-го интронов [14];
4) Линия agnts3 несет температурочувствитель-ную (ts) мутацию, полученную и поддерживаемую на фоне Canton-S. При ПЦР-картировании гена для limk1 у данной линии была обнаружена ин-серция 1.7 тпн S-элемента семейства Tc1/mariner на расстоянии около 1 тпн от 3'-UTR [14].
Мух выращивали в стаканчиках объемом 160 мл на стандартной изюмно-дрожжевой среде при
25 ± 0.5°С, 60%-ной влажности и свето-темновом цикле 12 : 12 ч. Вылупившихся насекомых без наркотизации сортировали по полу. Отбирали самцов анализируемой линии и помещали поодиночке в стаканчики со средой. В качестве объектов ухаживания для самцов всех анализируемых линий использовали оплодотворенных за сутки до опыта самок линии Canton-S. Исследования проводили на взрослых мухах в возрасте 5 сут при температуре 25 ± 0.5°С в первой половине дня.
Выделение РНК из голов D. melanogaster. Для экстракции РНК отбирали 70—80 голов 5-суточ-ных самцов дрозофилы. Головы гомогенизировали в 400 мкл раствора TRI-reagent (Sigma, США). Гомогенат центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин, 4°С). Отбирали надосадочную жидкость. К 350 мкл гомогената добавляли 80 мкл хлороформа и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин, 4°С). После разделения смеси на три фазы отбирали водную фазу, содержащую РНК. Для удаления примесей ДНК добавляли 20 мкл изо-пропанола (Fluka, Нидерланды), выдерживали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали (13 000 об/мин, 10 мин, 4°С). Отбирали су-пернатант, куда добавляли по 230 мкл изопропа-нола, и оставляли на 5 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин, 4°С). Удаляли супернатант и осажденную РНК дважды промывали 400 мл 75%-ного этанола. Затем центрифугировали (13000 об/мин, 5 мин, 4°С). Удаляли супернатант и осажденную РНК высушивали 5—10 мин, после чего растворяли в 15 мкл воды без РНКаз (Sigma, США). Приготовленные пробы хранили при —20°С.
Определение концентрации общей РНК в образцах проводили на спектрофотометре (Eppendorf Bio Photometer, Германия), измеряя оптическую плотность образцов при длине волны 260 нм в кюветах (Eppendorf UVette, Германия). Выравнивание концентраций РНК проводили с учетом данных фотометрирования.
Метод обратной транскрипции. После выравнивания концентраций отбирали по 1 мкг РНК и 15 мин при комнатной температуре обрабатывали ДНКазой I AMP-D1 (Sigma, США). Затем к 6.75 мкл раствора РНК добавляли 1.2 мкл случайных наномеров (Sigma, США). Смесь прогревали при 70°С 5 мин, после чего 1 мин выдерживали на льду. Затем добавляли 0.75 мкл 10 мМ раствора дНТФ (Хеликон, Россия), 0.3 мкл ингибитора ри-бонуклеаз (Calbiochem, США), 3 мкл 5х буфера для обратной транскриптазы (Promega, США) и 0.6 мкл обратной транскриптазы M-MLV RT (Promega, США). Смесь осаждали при 13000 об/мин 1 мин. Далее проводили реакцию обратной транскрипции в амплификаторе Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems, США) 1 ч при 37°С с последу-
ющей инкубацией при 85oC 5 мин для снижения образования вторичных структур кДНК, затем смесь остужали до 4oC.
Метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. К 1.5 мкл кДНК добавляли 7.5 мкл 2x cмеси для ПЦР Universal PCR Master Mix (Roche Molecular Systems, Inc., CШA). Затем добавляли 0.75 мкл праймеров к генам rp49 либо limkl в смеси с TaqMan Gene Expression Assays флуоресцентными ДНК-зондами (Applied Biosystems, CШA) и 5.25 мкл бидистиллированной воды. Cмесь осаждали (13000 об/мин, 1 мин), пробы раскапывали по 10 мкл в тетропликатах в 96-луночный планшет (Applied Biosystems, CШA). ПЦР проводили в установке StepOnePlus Realtime PCR systems (Applied Biosystems, CШA): 1) 2 мин при 50oC (активация урацил-^гликози-лазы); 2) 10 мин при 95oC (активация Taq-поли-меразы); 3) 15 с при 95oC (денатурация); 4) 1 мин при 60oC (элонгация). Огадии 3—4 повторяли 60 циклов.
Анализ уровня экспрессии мРНК. Для определения относительного содержания РНК-матрицы в пробе использовали метод оценки значения AACj,, где C — цикл амплификации на логарифмической стадии, при котором интенсивность флуоресцентного сигнала достигает пороговой величины, AC — разность между C для исследуемого продукта и эндогенного контроля, AACj, — разность ACj, для исследуемой и контрольной линий. В качестве эндогенного контроля использовали кДНК рибосомного белка rp49, в качес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.