научная статья по теме ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ГЛИЦИНОМ ОСОБЕННОСТИ ОСМОТИЧЕСКОГО ОТВЕТА ООЦИТА МЫШИ В ГИПОТОНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Биология

Текст научной статьи на тему «ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ГЛИЦИНОМ ОСОБЕННОСТИ ОСМОТИЧЕСКОГО ОТВЕТА ООЦИТА МЫШИ В ГИПОТОНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ»

УДК 599.3:591.31:578.61

ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ГЛИЦИНОМ ОСОБЕННОСТИ ОСМОТИЧЕСКОГО ОТВЕТА ООЦИТА МЫШИ В ГИПОТОНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

© 2014 г. М. А. Погорелова1, 2, В. А. Голиченков2, А. Г. Погорелов1*

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта: agpogorelov@rambler.ru 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,

119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 Поступила в редакцию 17.05.2013 г.

Посредством лазерной количественной микротомографии (QLSM) изучен вклад внеклеточного глицина в кинетику ответа зрелого ооцита мыши клетки на гипоосмотический стресс. Показано наличие у зрелого ооцита компенсаторной реакции (regulatory volume decrease, RVD). В отличие от зиготы и двухклеточного эмбриона RVD у ооцита не восстанавливает начальный клеточный объем даже на 120-й мин. Миллимолярные и субмиллимолярные концентрации глицина блокируют развитие RVD.

Ключевые слова: ооцит мыши, гипоосмотический стресс, компенсаторная реакция, глицин, лазерная количественная микротомография.

DOI: 10.7868/S0233475514010083

Клетки раннего эмбриона мыши содержат десятки миллимолей свободного глицина [1—3]. Это обстоятельство стало одной из предпосылок для рассмотрения внутриклеточного пула глицина в качестве осмотически активной компоненты при регуляции компенсаторного ответа в раннем эмбриогенезе [2, 4]. Интерес к участию глицина в осморегуляции обусловлен еще и тем, что на мембране клетки раннего эмбриона мыши функционирует специфичный транспортер GLYT1 [5, 6]. Этот Ма+(С1-)-зависимый транспорт обнаружили сначала в качестве механизма откачки глицина из синаптической щели нейрона [7]. Позже GLYT1 нашли у зрелого ооцита на стадии MII [3].

В ранних эмбрионах мыши трансмембранный перенос глицина изучали в связи с адаптацией к гиперосмотическим условиям, когда транспорт аминокислоты направлен в клетку [2, 6]. Отметим, что вектор переноса посредством GLYT1 обратим и может также обеспечить выход глицина из клетки, например, в синаптическую щель нейрона [7, 8]. Поэтому не исключено участие данного механизма в компенсаторной реакции на гипоосмоти-ческий стресс по типу RVD (regulatory volume decrease). Эффект RVD также зависит от неспецифичного транспорта аминокислот через VSOAC (volume sensitive organic osmolyte and anion channel), индуцируемого в гипотонических условиях [9, 10].

Схожий по своим фармакологическим и электрическим свойствам С1--канал обнаружен на мембране одноклеточного эмбриона мыши [11, 12].

Зрелый ооцит на стадии MII является непосредственным предшественником одноклеточного эмбриона. Во многом эффективность оплодотворения и, следовательно, качество автономно развивающейся яйцеклетки в ситуации как in vivo, так и in vitro обусловлена осмотичностью окружающей среды. Однако изучению механизмов адаптации ооцита к гипотоническому стрессу посвящены только единичные работы [3, 12]. Цель нашей работы состояла в изучении влияния глицина на течение RVD в зрелом ооците мыши. Такие исследования представляются актуальными не только для понимания фундаментальных механизмов регуляции осмотического ответа посредством трансмембранного транспорта аминокислот, они имеют и прикладное значение. Так криоконсерви-рованию подвергают, как правило, половые клетки, но не эмбрионы. В репродуктивных технологиях добавление аминокислоты в инкубационную среду позволяет преодолеть остановку в развитии зародыша in vitro, которая наблюдается, например, у мыши на стадии двухклеточного эмбриона [6].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на мышах SHK из питомника ИТЭБ РАН (г. Пущино). Во время эксперимента животных содержали в стандартных условиях: температура в комнате 20 ± 2°С, гранулированный корм ПК-121-2, питье at libitum. Воду, корм и подстилку меняли ежедневно без предварительной стерилизации. Ооциты, зиготы и двухклеточные эмбрионы получали в соответствии с методикой, описанной ранее [13, 14]. Осмотический шок моделировали уменьшением в среде Дульбекко концентрации NaCl до 70 мМ, что соответствует 170 мОсм раствора.

Принципы методики подготовки препарата, основанной на сверхбыстрой криофиксации биологической ткани, описаны нами ранее [15—17]. Начальным этапом является криофиксация объекта в жидком пропане (—188°С). Замороженные эмбрионы лиофилизировали в вакууме (~10-3 Pa) при низкой температуре (— 100°С), используя установку MBA 5 (Balzers, Лихтенштейн). По завершении низкотемпературной дегидратации высушенный объект заключали в заливочную среду, приготовленную на основе эпоксидной смолы Epon 812.

Объем ооцита, зиготы или отдельного бласто-мера двухклеточного эмбриона измеряли при помощи количественной лазерной микротомографии — QLSM [18—21]. Подготовленный препарат изучали в лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS (Leica, Германия). В режиме прошедшего света получали серию последовательных оптических срезов в вертикальном направлении с шагом 2 мкм. Учитывая низкий контраст полученного цифрового изображения, каждый срез дополнительно обрабатывали по унифицированному алгоритму, для чего использовали среду GIMP 2.2.17 (http://gimp-win.sourceforge.net) или Adobe Photoshop. На полученной микрофотографии в плоскости каждого оптического среза обводили границу изображения ооцита, зиготы или бластомера, затем по серии последовательных контуров получали трехмерную компьютерную модель клетки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение кинетики RVD ооцита, зиготы и двухклеточного эмбриона мыши. Изучение кинетики осмотического ответа клетки требует наличия подхода для измерения объема микрообъектов. В экспериментах с одноклеточным эмбрионом [22] и ооцитом [3] предполагали, что клетка имеет шарообразную форму. Сферическая экстраполяция позволяет косвенно, измеряя средний диаметр клетки, оценить ее объем. Более адекватным является метод прямого измерения объема,

апробированный применительно к бластомеру многоклеточного эмбриона мыши [23, 24]. В двух последних работах используется технология РЬ8М, примененная нами для измерения объемных характеристик одиночного ооцита (рис. 1).

Представляя полученные результаты, следует остановиться на следующем наблюдении. Даже для такой геометрически простой системы, как ооцит, сферическая экстраполяция вносит значительную ошибку. Прямое определение клеточного объема посредством РЬ8М (рис. 1а) дает величину на 13% меньше, чем при эмпирическом методе расчета по среднему радиусу ооцита (рис. 1б). Возможно, погрешность вносит полярное тельце, вклад которого в объем нельзя учесть при измерении линейных размеров клетки под световым микроскопом. На точность также влияет отсутствие строгой сферической формы (рис. 1в), что особенно проявляется при инкубации, когда ооцит распластывается по поверхности подложки (рис. 1г). Используя РЬ8М, мы определили кинетику изменения клеточного объема ооцита М11 мыши в течение гипоосмотического стресса (рис. 2).

У зрелого ооцита мыши ответ на гипоосмоти-ческий стресс длительностью 120 мин развивается в две фазы (рис. 2). В начале клетка набухает, достигая своего максимального размера в интервале 20 мин. В этот момент клеточный объем увеличивается приблизительно до 210 пл, что почти на 60% больше начального объема (120 пл). Затем инициируется ЯУО, когда за счет транспорта из клетки электролитов и органических осмолитов наблюдается восстановление размера клеточного объема.

Отметим, что по завершении компенсаторной реакции объем ооцита уменьшается только до значения около 180 пл. Данная величина в 1.3 раза больше объема изолированной яйцеклетки, регистрируемого в начале осмотического стресса. По-видимому, указанное расхождение обусловлено следующей причиной. В результате ЯУО ооцит стремится восстановить объем, соответствующий интактному состоянию, которое может отличаться по осмотичности от обычного раствора Дуль-бекко, используемого при выделении ооцитов [22, 23]. Возможно, в экспериментальной среде создаются условия, гиперосмотические относительно просвета яйцевода, где протекает заключительная фаза созревания женской половой клетки, оплодотворение и ранний эмбриогенез.

Первый клеточный цикл можно инициировать химическим агентом или механическим воздействием на зрелый ооцит. Поэтому, учитывая отношение объемов сперматозоида и ооцита (~1 : 106), отличие биологического оплодотворения от небиологических способов стимуляции состоит только в передаче информационного (генетиче-

Рис. 1. Сравнение результатов измерения объема ооцита посредством QLSM и эмпирическим методом на основе сферической экстраполяции. а — Изображение клетки после трехмерной реконструкции в QLSM; б — изображение поперечного сечения той же клетки, полученное на оптическом срезе, прошедшем через диаметральное сечение; в — вид "сверху" инкубируемой клетки, полученный после трехмерной реконструкции в QLSM; г — изображение поперечного сечения той же клетки, где стрелкой указана сторона плоскости адгезии с подложкой. Обозначения: V — объем ооцита в пиколитрах (пл), рЬИ — место полярного тельца, 2р — зона (пеллюцида), окружающая ооцит.

ского) материала, но не в факте массопереноса. Другими словами, слияние мужской и женской половых клеток не должно существенным образом модифицировать состав белков мембраны ооцита. Поэтому различие ответов зрелого ооцита и клетки раннего эмбриона, при идентичности комплекса мембранных механизмов, обусловлено разными наборами активных форм трансмембранного транспорта осмотически активных веществ [4, 6, 25]. Возможно, этим объясняется изменение кинетики у зиготы по сравнению с ооцитом (рис. 2). Для одноклеточного эмбриона характерно более медленное развитие адаптивного ответа, а также восстановление исходного объема к начальной величине.

Развитие ИУО двухклеточного эмбриона включает в себя признаки, характерные для обеих одноклеточных форм (ооцит и зигота). У бласто-мера, как и в ооците, регистрируется относительно быстрая компенсаторная реакция с выходом значения объема на плато (рис. 2). Различие интервалов времени, необходимых для набухания клетки эмбриона и ооцита, может быть обусловлен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком