ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 649-653
УДК 665.637:631.461.4
ОЧИСТКА ПОЧВЫ ОТ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩИХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2004 г. Э. Р. Рахимова, А. Л. Осипова, С. К. Зарипова
Казанский государственный университет, г. Казань, 420008; e-mail: Elza.Rakhimova@ksu.ru Поступила в редакцию 17.09.2003 г.
В лабораторных условиях исследовали эффективность применения нефтеокисляющего сообщества микроорганизмов в биоремедиации нефтезагрязненной почвы. Особенностью сообщества является способность эффективно окислять углеводороды нефти как в аэробных, так и в аноксических условиях. Степень разложения углеводородов нефти в вариантах биоремедиации за первые два месяца эксперимента увеличилась в ряду: самоочищение (40%) < внесение нитрата (42%) < интродукция денитрифицирующего нефтеокисляющего сообщества (50%) < интродукция денитрифицирующего нефтеокисляющего сообщества + внесение нитрата (60%). Интенсификация процесса биоремедиации связана с увеличением численности углеводородокисляющих микроорганизмов, прежде всего денитрифицирующих, при интродукции сообщества.
Нефть и нефтепродукты - наиболее масштабные загрязнители окружающей среды, попадающими в природные объекты как в результате нефтедобычи, транспортировки и хранения, так и со сточными водами промышленных предприятий [1]. В России ежегодный сброс нефти в окружающую среду достигает 25 миллионов тонн [2]. Существующие механические, термические и физико-химические методы очистки почв от нефтяных загрязнений дороги и экономически целесообразны лишь при определенном уровне загрязнения (как правило, более 1% нефти в почве) [1]. В настоящее время наиболее перспективным и экологически безопасным методом восстановления нефтезагрязненной природной среды является биоремедиация (bio - жизнь, remedio - лечение) - очистка загрязненных территорий посредством стимуляции деятельности биоты в почвах и водоемах. Это может быть биостимуляция природных микроорганизмов путем внесения удобрений непосредственно в загрязненную экосистему, или использование накопленных в лаборатории микроорганизмов из загрязненного экотопа, или применение специализированных препаратов микроорганизмов, созданных для очистки загрязненных экосистем [3, 4].
Несмотря на существенный объем рынка коммерческих препаратов, предназначенных для реме-диации нефтезагрязненных территорий [2, 4, 5], поиск новых деструкторов углеводородов нефти и выявление оптимальных условий эффективного использования имеющихся препаратов [6-8] продолжаются.
Одним из перспективных подходов к биоремедиации нефтезагрязненных территорий является использование факультативно анаэробных микроорганизмов, способных использовать в качестве терминального акцептора электронов и кислород, и нитрат-ионы.
Цель работы - оценка эффективности различных приемов ремедиации нефтезагрязненной почвы при использовании денитрифицирующего нефтеокисляющего сообщества (ДНС).
МЕТОДИКА
Схема опыта. Ремедиацию нефтезагрязненной почвы денитрифицирующим нефтеокисляющим сообществом проводили в лабораторных условиях. Испытывали следующие варианты биоремедиации нефтезагрязненной почвы: 1) самоочищение; 2) внесение нитрата (почва + нитрат); 3) интродукция денитрифицирующего нефтеокисляющего сообщества (почва + ДНС); 4) интродукция денитрифицирующего нефтеокисляющего сообщества + + внесение нитрата (почва + ДНС + нитрат).
Почву однократно загрязняли нефтью из расчета 100 г/кг. Для активизации аборигенной угле-водородокисляющей микрофлоры в почву вносили нитрат в виде КК03 в соотношении С : N = 100 : 1. ДНС вносили в нефтезагрязненную почву из расчета 2 х 106 кл./г почвы.
Процесс ремедиации проводили при 18-25°С, периодическом рыхлении и увлажнении почвы. В контрольных вариантах использовали незагрязненную почву как без внесения, так и с внесением нитрата.
Характеристика денитрифицирующего нефтеокисля-ющего сообщества
Штамм, особенность морфологии Степень нефте-деструкции, % Денитрифицирующая активность
Н0М1 (дрожжи) 28 -
Н0М2 (дрожжи) 40 -
Н0М3 (дрожжи) 49 -
Н0М4 (гр-) 24 ++
Н0М5 (гр-) 18 +
Н0М6 (гр+) 17 +
Н0М7 (гр-) 18 +
Н0М8 (гр+) 28 +
Н0М9 (гр+) 30 ++
Н0М10 (гр-) 35 +++
Н0М11 (гр-) 9 ++
Н0М12 (дрожжи) 27 -
Н0М13 (гр-) 9 +
Примечание: "-", "+", "++", "+++" - степень денитрифицирующей активности; "гр-", "гр+" - грампринадлежность.
Почва. В вегетационные сосуды вносили по 10 кг дерново-карбонатной почвы, имеющей следующую характеристику: структура - комковато-пы-леватая, средний суглинок, солевой рН 7.28. Содержание органогенных элементов (мг/100 г почвы): азот легкогидролизуемый - 37.5, фосфор Р205 - 63.2, калий обменный К20 - 2.8.
Нефть Елховского месторождения (республика Татарстан) имела следующие характеристики: среднее содержание парафинов 5.2%, серы 1.3%, удельный вес 0.8617 г/см3.
Денитрифицирующее нефтеокисляющее сообщество. В качестве интродуцируемых микроорганизмов-деструкторов использовали ДНС, созданное из микроорганизмов, выделенных из почвы с хроническим загрязнением вблизи нефтяных скважин на территории нефтегазодобывающего управления "Елховнефть" и способных разлагать нефть в условиях денитрификации [9]. Биомассу денитрифицирующих микроорганизмов-деструкторов выращивали в жидкой питательной среде для углеводородокисляющих микроорганизмов [10] с добавлением КК03 (2 г/л) в течение 5 сут в условиях лимита кислорода.
Учет численности микроорганизмов. В ходе эксперимента численность аэробных и денитрифицирующих гетеротрофных микроорганизмов контролировали по [11].
Численность углеводородокисляющих аэробных и денитрифицирующих микроорганизмов определяли методом предельных разведений на среде следующего состава (г/л): (КН4)28 04 - 1.0; М§Б04 - 1.0; КаС! - 1.0; дрожжевой экстракт -
50 мг/л; вода водопроводная, рН 7.0 - 7.2. В качестве источника углерода использовали дизельную фракцию нефти в концентрации 1%. В случае денитрифицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов в среду дополнительно вносили КК03 (2 г/л). Культивирование аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов проводили 7-10 сут в 250 мл колбах с 15 мл среды, денитрифицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов - 14 сут в пробирках с 15 мл среды (высота слоя жидкости 14-15 см). О наличии роста судили по помутнению среды и диспергированию нефти.
Содержание нефти. Почвенные пробы экстрагировали равным объемом четыреххлористого углерода. Экстракты обрабатывали согласно ОСТу 38.01378-85 [12].
Определение нитратов и нитритов. Нитраты в почве регистрировали фотометрически с салици-латом натрия, нитриты - фотометрическим методом с сульфаниловой кислотой и а-нафтилами-ном [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Использованное в работе денитрифицирующее нефтеокисляющее сообщество способно расти и активно разрушать углеводороды нефти как в аноксических условиях, так и в условиях принудительной аэрации, в широком диапазоне рН, причем в условиях денитрификации процессы окисления нефти осуществлялись с большей эффективностью [9]. ДНС состояло из 13 активных штаммов. Из них 4 - Н0М1 - Н0М3, Н0М12 - отнесены к дрожжам, 3 - Н0М6, Н0М8, Н0М9 - к грамположительным бактериям, остальные 6 штаммов - к грамотрицательным. Наибольшей денитрифицирующей активностью обладали штаммы Н0М4, Н0М9, Н0М10, Н0М11, Н0М12, неф-теразлагающей активностью - штаммы: Н0М2, Н0М3, Н0М10 (таблица).
Численность микроорганизмов. Нефть оказалась токсичной для гетеротрофных аэробных микроорганизмов: их численность в вариантах с нефтяным загрязнением была на 1-2 порядка ниже, чем в чистой почве.
Внесение в нефтезагрязненную почву сообщества бактерий или нитрата оказало положительный эффект на гетеротрофные аэробные микроорганизмы. При интродукции ДНС количество последних достигало максимального значения через 12 нед, разница с вариантом самоочищения к этому времени составила 3 порядка. Внесение нитрата привело к увеличению общей численности аэробных гетеротрофов в 2-25 раз по сравнению с контрольным вариантом. Следует отметить, что на протяжении всего опыта различие на уровне 1-2 порядка сохранялось между этими варианта-
^ N 14
12 10
8 6
4
2
0 10 9 8 7 6
5 4 3 2 1 0
12
(а)
I II
5
34
ш
Н
щ
I
Й
12
м
ш
(б)
¡И
Ш
ш
йЙ
I,1
12
18
33
38 нед
Рис. 1. Изменение численности (^N) гетеротрофных (а) и углеводородокисляющих (б) микроорганизмов. 1 - незагрязненная почва, 2 - незагрязненная почва + нитрат, 3 - нефтезагрязненная почва, 4 - нефтезагрязненная почва + + ДНС", 5 - нефтезагрязненная почва + нитрат", 6 - нефтезагрязненная почва + ДНС + нитрат; I - аэробные микроорганизмы, II - денитрифицирующие микроорганизмы.
ми. Наименьшее токсическое действие нефти на гетеротрофные аэробные микроорганизмы наблюдали в варианте почва + ДНС + нитрат. Количество аэробных гетеротрофов в данном варианте было сопоставимо или даже превышало численность таковых в незагрязненной почве (рис. 1а).
В ходе исследования во всех вариантах эксперимента отмечены флуктуации численности микроорганизмов. Вероятно, это связано с последовательным потреблением отдельных углеводородов нефти, что определяет сукцессию ассоциаций микроорганизмов [14].
По данным некоторых исследователей, использование азотных удобрений может привести к ин-гибированию почвенных микроорганизмов [7]. В наших экспериментах нитрат не подавлял гетеротрофные аэробные микроорганизмы и снижал токсическое действие нефти на их рост. О токсичности для микроорганизмов именно нефти, а не нитрата свидетельствовало изменение численности аэробных микроорганизмов в незагрязненной почве с внесением нитрата: численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов была в
этом случае выше таковой в почве без внесения нитрата (рис. 1а).
В отличие от аэробных гетеротрофов численность денитрифицирующих гетеротрофов при загрязнении почвы нефтью возрастала по сравнению с незагрязненной почвой. Разнонаправленность тенденции изменения численности аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов при нефтяном загрязнении может быть связана с созданием в нефтезагрязненной почве анаэробных усло
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.