БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.805-812
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.323
ОСОБЕННОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ПРОФЛАВИНА C ДНК ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СООТНОШЕНИЯХ ИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ
© 2009 г. Е.Г. Березняк, Н.А. Гладковская, А.С. Хребтова, Е.В. Дух опельников, А.В. Зинченко*
Институт радиофизики и электроники НАН Украины, 61085, Xарьков, ул. А кадемика Проскуры, 12, Украина; *Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, 61015, Харьков, ул.Переяславская, 23,
Украина E-mail: berez@ire.kharkov.ua Поступила в p едакцию 02.02.09 г.
Методами дифференциальной сканирующей калориметрии и спектрофотометрии исследовано взаимодействие профлавина с тимусной ДНК. Показано, что пр офлавин обр азует на матрице ДНК как минимум три типа комплексов. П р и высоких значениях соотношения ДНК и лиганда в зависимости от нуклеотидной последовательности образуются два комплекса по типу интеркаляции с предпочтительным встраиванием в GC-пары. При низких значениях этого соотношения пр офлавин связывается с ДНК по внешнему типу. Из спектр офотометр ических концентр ационных зависимостей рассчитаны параметры комплексообразования пр офлавина с ДНК. Методом диффер енциальной сканирующей калориметрии получены термодинамические пар аметры плавления ДНК в со ставе этих комплексов.
Ключевые слова: калориметрия, спектрофотометрия, ДНК, профлавин, комплексообразование.
П p офлавин и другие производные акридина обладают мутагенными и противоопухолевыми свойствами [1]. Природу их биологической активности связывают с интеркаляционным типом взаимодействия с ДНК, которое возникает пр и высоких значениях соотношения ДНК и лиганда (P/D) и приводит к значительным изменениям физико-химических свойств ДНК [2,3]. До сих пор вопрос о предпочтительности связывания профлавина с различными нуклео-тидными последовательностями остается открытым. Для встраивания хромофора профла-вина между GC-парами ДНК Л.C. Лерманом предложена интеркаляционная модель взаимодействия [4]. Позже было обнаружено, что профлавин также образует комплексы с дву-спиральной ро1у(А), ро1у(ёЛ-ёТ) и другими синтетическими полинуклеотидами, в том числе и односпиральными [5-7]. В работе [8] было показано, что профлавин может связываться с любой нуклеотидной последовательностью со случайным распределением АТ- и GC-пар, равновероятно встраиваясь при этом в сайты Л-Т Л-Т G -C _
гг л, . Однако свойства профлавина
Т-Л G -C C-G
в составе этих комплексов различаются.
Сокращения: Д СК - дифференциальная сканирующая калориметрия, Pf - профлавин.
Цель данной работы - выяснить специфичность и о собенности связывания профлавина с АТ- и GC-пар ами. В качестве матрицы мы выбрали ДНК из тимуса теленка, поскольку она состоит из блоков различного АТ/GC состава. И сследования проводили в широком интервале P/D, в том числе и при низких значениях P/D < 3, где профлавин обр азует комплексы по типу внешнего связывания с саха-рофосфатным остовом [2,9]. В работе использовали методы спектрофотометрии и дифференциальной сканирующей калориметрии ^CК). Выбор двух этих методов не случаен. Cпектpофотометpические исследования позволяют наблюдать за поведением лиганда при образовании разных типов комплексов. В тоже вр емя за изменениями полинуклеотидной матрицы, вызванными связыванием с лигандом, можно проследить с помощью метода ДCК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали коммерческую ДНК из тимуса теленка фирмы Serva (содержание GC-пар 42%) и профлавин (Pf) фирмы Sigma без дополнительной очистки. Структурная формула профлавина пр иведена на рис. 1. Все исследования смесей Pf - ДНК пр оводили в фосфатном буфер ном растворе (2,5-10-3 M KH2PO4,
P ис. 1. C труктур ная фор мула пр офлавина.
2,510-3 M Na2HPO4, рН 6,86) c добавлением NaCl (ионная сила « 0,02 М).
Измер ения спектр ов поглощения смесей Pf-ДНК пр и разных значениях P/D пр оводили на спектрофотометре Бресогё M40 (Германия) в видимой и УФ -областях спектра. Поглощение в смесях лиганд-ДНК согласно закону Ламбер-та-Бер а можно пр едставить в виде:
А = Ход
(1)
где Сг- и £• - концентр ация и значение моляр ного коэффициента поглощения каждой частицы в исследуемой системе, I - длина оптического пути.
При определении концентрации тимусной ДНК в молях нуклеотидов (Ср) использовалось значение моляр ного коэффициента поглощения 82б0 = 6,4-103 М -1-см-1 [10]. Значение моляр ного коэффициента поглощения Pf определяли экс-пер иментально.
Расчет констант связывания пр офлавина с ДНК пр оводили с использованием пр огр аммы оптимизации БЛЬБМОБ, которая позволяет получить пар аметр ы связывания лигандов с полиэлектролитными матрицами [11,12]. Оптимальные значения молярных коэффициентов поглощения комплексов и соответствующие константы связывания получены путем минимизации суммы квадр атов отклонений наблюдаемы х оптических плотностей А ^ (в /-м раствор е пр и ]-й длине волны) от р асчетных, вычисляемых по закону Ламбер та -Бер а. С оответ-ствие выбранной модели экспериментальным данным опр еделяли путем ср авнения фактор ов Гамильтона () с предельными значениями фактор ов Гамильтона () Ит, котор ые ра ссчитывали пр и каждом выходе из пр огр аммы оптимизации с учетом ошибок в измер ении оптической плотно сти (ДА = 0,005) и общих концентр аций (1%). Модель удовлетво р яла экспер иментальным данным пр и () < () Ит. П р оцесс оптимизации по-вто рялся на той же базе данных пр и р азных значениях п и ш, где п - число нуклеотидов, занимаемых связанным лигандом на матрице ДНК; ш - факто р коопер ативно сти, хар актер и-зующий обр азование агр егатов на том же месте
связывания. Ошибка пр и вычислении значений величин п и К по пр ограммам оптимизации спектр офотометр ических концентр ационных за -висимостей составляла не более (5-7)%.
Измер ения теплопоглощения свободной ДНК и ДНК в комплексах с профлавином пр оводили на диффер енциальном сканир ующем микр окалор иметр е БЛ8М-4 с объемом измер и-тельной ячейки 0,4553 мл при скор о сти пр о -гр ева раствор ов 1 гр ад/мин. Мощность калибр овочного импульса со ставляла 25-10-6 Вт. И с-следования пр оводили в р аствор ах с концентр ацией ДНК Ср = 3-10-3 М. Зависимо сти избыточной молярной теплоемкости от темпер а-тур ы получены с учетом базовой линии, пр о -веденной между точками, соответствующими температурам начала и конца перехода [13].
Изменения энтальпии ДН, энтропии Д5 и свободной энергии Гиббса ДО для процесса тепловой денатурации ДНК рассчитывали на моль нуклеотидов по стандар тным ур авнениям:
AH
Jac р dT,
(2)
AS = J ^dT,
AG = AH - TAS.
(3)
(4)
Расчет пар аметр ов связывания из данных Д С К пр оводили по ур авнению МакГи [14]. П р и отсутствии взаимодействия лиганда с расплетенными участками ДНК разница между темпер атур ами плавления ДНК в комплексе с лигандом (Тт) и свободной ДНК (Г®т) выражается следующим обр азом:
11 —
- = — ln (1 + KT L )1 /n, Tm Tm AH Tm ' '
(5)
где ДН - энтальпия плавления свободной ДНК, опр еделенная методом Д С К; Я - газовая постоянная; Кт - константа связывания лиганда
т
с ДНК пр и Тт; п - величина места связывания; L - концентр ация свободного лиганда пр и Тт.
Значение L ра ссчитывали в пр едположении, что плавление ДНК сопровождается отрывом лиганда, и пр и Т = Тт половина связанного лиганда пер еходит в свободное со стояние:
T
T
T
т = т T=25 + Ч T=25 ^ _ своб 2 связ '
(6)
где LТв=о2б5 и LТвя^з5 - концентрации свободного и связанного лигандов в смеси при данном значении P/D.
Константу связывания K профлавина с ДНК пр и Т = 25°C р а ссчитывали по ур авнению Вант -Гоффа:
ln
K
K
AH
R
1 _ J_ T T
(7)
m У
где АНсв - энтальпия связывания, пр иходящаяся на моль лиганда.
Для определения энтальпии связывания из данных ДСК мы воспользовались подходом, согласно котор ому изменение энтальпии плавления ДНК в комплексе по сравнению с энтальпией плавления свободной ДНК вызвано только взаимодействием лиганда с двуспир аль-ной ДНК [15,16]:
ёвДНК - Pf ^ 88ДНК + Pf AHДНК-^
ёвДНК ^ 88ДНК AHДНК
ёвДНК^ ^ ёвДНК +Pf SAH
SAH = АНДНК-^ - AHДНК, +
(8)
где ё8ДНК и 88ДНК - двуспиральная и одно-спир альная ДНК соответственно.
Энтальпию связывания ЛНс из соотношения:
р а ссчитывали
SAH = ( - AH V,
(9)
где г - количество молей лиганда, связанных с одним молем нуклеотидов. Величину г определяли как отношение равновесной концентр а -ции лиганда в со ставе комплекса к общей концентр ации ДНК.
С использованием АНсв и К можно рассчитать свободную энер гию Гиббса АО = -ЯТ1и К, энтр опию А5 = (АЯ - АО)/Т и, таким обр азом, получить полное тер модинамическое описание взаимодействия лиганда с ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для опр еделения концентр ации пр офлавина (Св) необходимо знать значение величины моляр ного коэффициента поглощения е в изобес-тической точке, соответствующей мономер-ди-мер ному равновесию лиганда. В работах [6,7,17] пр иведены р азличные значения е для пр офла-
Р ис. 2. Спектр ы поглощения смесей Pf - ДНК пр и различных концентрациях ДНК (а) и зависимость интенсивности поглощения смесей Pf - ДНК (Я = 460) нм от Р/Б (б) пр и постоянной концентр ации лиганда СБ = 2,34-10-5 М.
вина, поэтому мы провели собственные изме-р ения спектр ов поглощения ра створ ов Р£ Ра створы были приготовлены из одного концентр ир ованного обр азца путем разведения в 4, 8 и 40 раз. По программе оптимизации БАЬБ опр еделены моляр ные коэффициенты поглощения мономер ной и димер ной фо р м Р£ а также константа димеризации лиганда [18]. Значение моляр ного коэффициента поглощения в изобес-тической точке е444 = 4,1-104 М-1-см-1 совпадает с данными работ [7,19,20]. Значение константы димер изации КБ = (2,3 ± 0,2)-103 М-1 использовали в дальнейшем пр и р асчете пар аметр ов связывания в системе Pf - ДНК.
m
Рис. 3. Модель образования кооперативного (1 и 1') и некооперативного (2) комплексов на двух разных местах связывания.
На рис. 2а пр иведены спектр ы поглощения смесей Pf - ДНК в видимой области. Видно, что в системе Pf - ДНК присутствуют более чем два по-р азному поглощающих компонента. Это следует из того, что изобестическая точка, появляющаяся в области низких значений Р/Б (X = 457 нм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.