УСПЕХИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК, 2013, том 44, № 1, с. 3-16
УДК 576.08
ОДИНОЧНАЯ КЛЕТКА: ОТ ФИЗИОЛОГИИ К АНАЛИЗУ ТРАНСКРИПТОМА
©2013 г. М.Ф. Быстрова, А.С. Колесникова, С.С. Колесников
Институт биофизики клетки РАН, Пущино
В настоящее время экспрессионный анализ является неотъемлемой частью исследований в области физиологии одиночной клетки, поскольку он позволяет идентифицировать ключевые рецеп-торные, сигнальные, регуляторные и канальные белки, вовлеченные в те или иные внутриклеточные процессы в индивидуальных клетках. Обзор рассматривает основные методические приемы и достижения в области анализа профиля экспрессии генов на уровне одиночной клетки. Особое место уделено прогрессу, достигнутому с применением методов молекулярного анализа, в области исследования молекулярных и клеточных механизмов обоняния и вкуса.
Ключевые слова: одиночная клетка, амплификация РНК, клеточная гетерогенность, обонятельный нейрон, вкусовая клетка.
Все клетки многоклеточного организма обладают одинаковым набором генов, а морфологические и функциональные отличия генетически однородных клеток разного типа определяются тем, какие гены в них экспрессированы. Композиция мРНК транскриптов, присутствующих в клетке, т.е. клеточный транскриптом, определяет ее физиологические свойства. При исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе тех или иных клеточных функций, чрезвычайно актуальной задачей становится выявление корреляций между функциональным и молекулярным фенотипами индивидуальных клеток. Клетка -это базовый элемент сложных биологических систем, поэтому неудивительны многочисленные усилия исследователей, направленные на то, чтобы изолировать одиночные клетки, исследовать их морфологические, функциональные и молекулярные свойства и сравнить индивидуальные клетки между собой. Проводя исследования на ткани или с использованием клеточной культуры, содержащих тысячи или даже миллионы клеток, мы получаем усредненные данные. Насколько точно усредненные измерения отражают поведение и свойства индивидуальных клеток в системе?
Обычно принимается как должное, что усредненные измерения отражают признаки популя-ционного большинства или доминирующий механизм, оперирующий в системе. Но так ли это? Вряд ли возможно получить ответы на эти и подобные вопросы без проведения сравнительных
экспериментов на уровне одиночных клеток. До недавнего времени индивидуальные клетки можно было изучать только на функциональном уровне с использованием методов микроскопии, микрофотометрии и электрофизиологии. Разработка высокочувствительных технологий экспрессионного анализа расширила экспериментальные возможности, сделав реальным исследование молекулярного фенотипа одиночных клеток. Комбинированное использование молекулярных исследований и функциональных тестов позволяет идентифицировать ключевые рецептор-ные, сигнальные, регуляторные и/или канальные белки, которые вовлечены в те или иные физиологические процессы в индивидуальных клетках. Именно такому сочетанию методов мы обязаны возникновению самостоятельного направления в физиологии - молекулярной физиологии клетки. В данном обзоре анализируются методы, используемые в текущей исследовательской практике для анализа профиля экспрессии генов на уровне одиночных клеток, включая хемо сенсорные клетки, исследование которых лежит в области интересов авторов.
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК
Считается, что в типичной клетке активны примерно 10000 генов, и с них транскрибируются несколько сотен тысяч разнообразных молекул
мРНК [28, 32]. Методы экспрессионного анализа позволяют охарактеризовать спектр мРНК транс-криптов, присутствующих в клетке в момент ее лизиса. Анализ мРНК транскриптов на уровне одиночной клетки долго считался практически неразрешимой проблемой. Трудности, связанные с выполнением такого рода исследований, очевидны. Во-первых, существует проблема выделения из ткани, как правило, неоднородной с точки зрения клеточных типов, одиночных живых клеток с сохранением свойственных им морфологических и функциональных признаков. Для выделения индивидуальных клеток необходима процедура механической и энзиматической диссоциации ткани. После диссоциации многие клетки теряют форму и характерные морфологические признаки, поэтому встает проблема правильной идентификации изолированной клетки. Во-вторых, ограничивающим фактором при проведении экспрес-сионного анализа является чрезвычайно малое количество мРНК, присутствующее в одиночной клетке. Считается, что типичные клетки содержат в среднем 10-20 pg тотальной РНК, из которой на долю мРНК приходится не более 5%. Таким образом, в одиночных клетках содержатся лишь фемтограммы транскриптов мРНК индивидуальных генов. Такие мизерные количества сложно подвергать экспериментальным манипуляциям, типичным для работы с тотальными препаратами, поскольку они ведут к неизбежным потерям исходного материала. По количеству копий на клетку мРНК транскрипты можно разделить на 3 группы: высокой, средней и низкой представленности. Последняя группа (1-15 копий на клетку) составляет примерно 90% всех транскриптов мРНК в клетке [1]. Причем данные по серийному анализу экспрессии генов указывают на то, что порядка 80% транскриптов присутствуют в клетке именно в количестве нескольких копий [56]. Другими словами, объектом исследования в случае индивидуальной клетки являются единичные молекулы мРНК.
В конце прошлого века для анализа профиля экспрессии генов в образцах, содержащих ничтожно малые количества мРНК, были разработаны методы глобальной амплификации РНК [4, 7, 55]. В настоящее время существуют две основных технологии глобальной амплификации, которые иногда применяются в комбинации друг с другом: линейная амплификации РНК с помощью транскрипции in vitro [18, 55] и экспоненциальная амплификация комплементарных ДНК (кДНК) с использованием ПЦР [7]. Нужно отметить, что в целом ряде работ, где описаны протоколы, об-
ладающие чувствительностью, необходимой для анализа одиночной клетки, реально представлены эксперименты не с РНК, выделенной из одиночной клетки, а с РНК, выделенной из ткани, клеточной популяции или клеточной культуры и разбавленной до уровня одиночной клетки [51]. Протоколы, разработанные для анализа одиночных клеток человека, могут быть менее эффективны при исследовании клеток мыши, содержащих только 10-20% от количества тотальной РНК клеток человека [22].
Первый успешный анализ экспрессии генов на уровне одиночных клеток был проведен в 1992 г. [18] с использованием технологии линейной амплификации антисмысловых РНК (аРНК), получившей название "метод Эбервайна" [18, 55]. Суть метода состоит в следующем. Для обратной транскрипции мРНК матрицы используется модифицированный олиго(дТ)-нуклеотид, содержащий на 5'- конце последовательность промотора РНК полимеразы фага Т7. Этот олигонуклеотид в настоящее время известен как "праймер Эбер-вайна". Гибрид РНК-кДНК обрабатывается РНКазой Н, и затем синтезируется вторая цепь кДНК. Полученные молекулы двухцепочечной ДНК содержат последовательность промотера РНК полимеразы фага Т7 и, следовательно, могут быть использованы в качестве матрицы для транскрипции in vitro аРНК с помощью Т7 РНК полимеразы. Амплифицированная аРНК обрабатывается ДНКазой I и затем используется в качестве матрицы для проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) со случайными праймерами-гексамерами. Полученная кДНК затем используется как матрица в ПЦР с ген-специфическими праймерами. В принципе, можно использовать эту кДНК еще для одного или нескольких циклов линейной амплификации, поскольку она содержит последовательность промотера Т7 РНК поли-меразы. Степень амплификации может достигать 103-106 при использовании от одного до трех циклов, соответственно. Несомненное достоинство метода Эбервайна состоит в том, что он позволяет не только глобально амплифицировать мРНК одиночной клетки, но и сохранить относительные уровни транскриптов различных генов в исходном образце.
Методология линейной амплификации аРНК впервые была применена сначала для анализа одиночных клеток Пуркинье, а затем пирамидальных нейронов изолированных из гиппокампа крысы [18]. Эта работа замечательна тем, что в ней впервые одиночные нейроны были иссле-
дованы с использованием комбинации методов функционального и молекулярного анализа. Нейрон сначала подвергался электрофизиологическому исследованию с помощью метода пэтч-кламп, а затем экспрессионному анализу. Таким образом, были получены и физиологические и молекулярные характеристики индивидуальных клеток. Интересно, что уже в этом первом исследовании, выполненном на уровне одиночной клетки, был выявлен феномен клеточной гетерогенности: нейроны одного типа с одинаковыми электрофизиологическими характеристиками имели различные профили экспрессии исследованных генов [18].
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ ХЕМОСЕНСОРНЫХ НЕЙРОНОВ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Еще одна стратегия глобальной амплификации - экспоненциальная амплификации кДНК по методу Брэди [7] - впервые была применена при исследовании одиночных обонятельных ре-цепторных нейронов, изолированных из главного обонятельного эпителия. Эти клетки специализируются на детекции молекул запахов, усилении сигнала, его кодировании в форме электрических импульсов и передаче информации в обонятельную луковицу для дальнейшей обработки. Гены обонятельных рецепторов составляют самое большое семейство в геномах млекопитающих. Это семейство у разных животных насчитывает от 900 до 1400 представителей [34]. Каждый обонятельный нейрон в обонятельном эпителии экспрессирует только один ген из семейства обонятельных рецепторов, и этим определяется его функциональная специфичность. Общепринятая в настоящее время гипотеза "один нейрон - один рецептор" была впервые сформулирована на основе результатов экспрессионного анализа одиночных обонятельных нейронов мыши. В ответ на запахи в обонятельных нейронах происходит кратковременное повышение уровня кальция, которое можно зафиксировать с помощью методов микрофотометрии (Ca2+ imaging). Индивидуальные обонятельны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.