БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том З7, № З, с. ЗЗ4-З4З
УДК 577.2:08З.З
ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, НАПРАВЛЕННЫЕ К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ
© 2011 г. М. А. Вихрова*, Т. А. Батанова**, Л. Р. Лебедев**, Л. Н. Шингарова***, Л. А. Франк****, М. П. Кирпичников***, Н. В. Тикунова*#
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8; **ФГУНГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Новосибирская обл., Кольцово; ***Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; ****Институт биофизики СО РАН, Красноярск, Академгородок Поступила в редакцию 14.07.2010 г. Принята к печати 14.09.2010 г.
Из сконструированной ранее неиммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека методом аффинной селекции были отобраны шесть уникальных фаговых антител против TNF человека. Связывание отобранных фаговых антител с TNF исследовали методами ИФА и Вестерн-блот-анализа. Специфичность отобранных антител определяли по связыванию с интерферонами альфа и гамма, бычьим сывороточным альбумином, овальбумином и убиквитином. Два антитела, sA1 и sB3, переведены в формат растворимых одноцепочечных антител в виде индивидуальных молекул; их аффинность составила 2.5 и 13.7 нМ соответственно.
Ключевые слова: фаговый дисплей, одноцепочечные антитела человека, аффинность, TNF человека.
ВВЕДЕНИЕ
Фактор некроза опухолей человека (TNF) — главный медиатор острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основная его роль заключается в способности индуцировать провоспалительные медиаторы, такие, как интерлейкины 1 и 6, грануло-цитарный макрофагальный колониестимулирую-щий фактор, а также белки-хемоаттрактанты [1]. Известно, что главным стимулятором запуска продукции TNF является бактериальный липополиса-харид, а основным источником TNF в организме — активированные мононуклеарные фагоциты, хотя стимулированные Т-клетки, натуральные киллеры (NK-клетки) и тучные клетки также могут секрети-ровать этот белок [1]. При тяжелых инфекциях TNF, продуцируемый в большом количестве, приводит к развитию большого числа системных нарушений. Так, воздействуя на гипоталамус, TNF индуцирует лихорадку. Кроме того, TNF оказывает воздействие на печень, в частности, увеличивая синтез гепато-цитами сывороточных воспалительных белков, а также вносит ощутимый вклад в развитие локальных воспалительных реакций. Пролонгированная
Сокращения: BSA — бычий сывороточный альбумин; IFN — интерферон; IgG — иммуноглобулины класса G; OVA — овальбумин; scFv — одноцепочечные антитела; TNF — фактор некроза опухолей человека; UBI — убиквитин; БОЕ — бляш-кообразующая единица; ИФА — иммуноферментный анализ; МКА — моноклональные антитела.
#Автор для связи (тел.: (383) 363-51-57; эл. почта: tikuno-va@niboch.nsc.ru).
продукция TNF вызывает метаболические повреждения, включая кахексию и шоковый синдром [2, 3]. Поэтому факторы, блокирующие действие данного цитокина (TNF-блокаторы), представляют интерес для терапии ряда патологий, включая ревматоидный артрит, псориаз и другие аутоиммунные заболевания, а также вирусных геморрагических лихорадок. К TNF-блокаторам относят растворимые рецепторы TNF, ингибиторы синтеза и высвобождения TNF и специфические антитела против TNF [4—8]. Наиболее перспективными для использования в качестве медицинских препаратов являются полноразмерные антитела человека против TNF.
К настоящему времени на российском рынке терапевтических препаратов, блокирующих TNF, имеются полноразмерные IgG1 человека (Adali-mumab, Humira®) и химерные антитела (Infliximab, Remicade®) [5, 9]. Основной недостаток последнего препарата — его относительно высокая иммуногенность, обусловленная присутствием последовательности из мышиных антител, что препятствует использованию такого препарата в длительных курсах терапии. Стоимость полноразмерных антител человека Adalimumab высока и в России в настоящее время составляет в среднем 79 тыс. руб. за месячный курс при необходимости проведения терапии в течение 2—3 лет. В связи с этим ведутся разработки новых вариантов препаратов антител против TNF, в том числе включающих другие форматы молекул анти-TNF-антител.
Так, разработан новый препарат полноразмерного антитела, блокирующего TNF, голимумаб (Golimumab), по своим свойствам не уступающий имеющимся на рынке препаратам, который успешно прошел третью стадию клинических испытаний [10]. Кроме того, на фармацевтическом рынке появился препарат гуманизированных Fab-фрагментов антител против TNF, присоединенных к молекуле полиэтиленгликоля (Certoli-zumab pegol, Cimzia®). Вместе с тем известно, что при длительном применении всех вышеперечисленных препаратов возможно возникновение серьезных осложнений, в частности развитие латентных форм туберкулеза [11] и инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями Legionella, Listeria, Shigella [12]. Все это приводит к необходимости продолжения разработки новых вариантов антител против TNF.
При создании рекомбинантных антител ключевым моментом является наличие высокоспецифичных вариабельных доменов антител. Один из способов их получения основан на технологии фагового дисплея, которая позволяет отбирать из комбинаторных библиотек вариабельные домены в виде одноцепочечных антител (scFv) или Fab-фрагмен-тов. Каждый клон такой библиотеки продуцирует уникальное фаговое антитело, представляющее собой scFv, экспонированное на поверхности нитчатого бактериофага в составе химерного белка на ^-конце минорного оболочечного фагового белка p3. Между последовательностями, кодирующими встраиваемое scFv-антитело и белок р3 бактериофага М13, находится амберный стоп-кодон TAG, который в супрессорных (supE) штаммах E. coli транслируется как остаток глутаминовой кислоты, и поэтому в supE-штаммах E. coli происходит продукция одноцепочечных антител в составе химерного белка с оболочечным фаговым белком р3. При использовании несупрессорного штамма E. coli scFv-антитело продуцируется в виде индивидуль-ных молекул без оболочечного белка. На С-конце молекул одноцепочечных антител, как правило, находится C-myc-эпитоп для детекции этих антител и гексамер гистидина для их очистки [13].
Цель данной работы заключалась в отборе одноцепочечных антител человека против TNF из сконструированной нами ранее неиммунной (наивной) комбинаторной библиотеки scFv-антител [14] и изучении свойств отобранных антител.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее на основе суммарной мРНК, выделенной из периферических лимфоцитов шести здоровых доноров, нами была сконструирована фаг-мидная комбинаторная библиотека одноцепо-чечных антител человека представительностью 2 х 108 независимых клонов [14]. Полагают, что в библиотеках такого размера содержится реперту-
ар антител, присутствующих в организме здоровых людей [15].
Известно, что для отбора специфичных антител из комбинаторных библиотек на первом этапе проводят, как правило, 2—5 раундов аффинной селекции (биопэннинга) исходной библиотеки. Процедура биопэннинга представляет собой инкубацию фагмидной библиотеки антител с целевым антигеном с последующей отмывкой несвя-завшихся и элюцией связавшихся с антигеном бактериофагов, несущих на своей поверхности уникальные одноцепочечные антитела. Элюиро-ванные бактериофаги, экспонирующие специфичные одноцепочечные антитела, амплифици-руют в клетках E. coli и используют для следующих раундов биопэннинга или для скрининга.
В данной работе аффинное обогащение библиотеки клонами, продуцирующими фаговые антитела, специфичные к TNF, проводили в ходе трех раундов аффинной селекции. Поликлональ-ные фаговые популяции, полученные в результате каждого раунда биопэннинга, а также исходную фаговую библиотеку, тестировали методом ИФА для оценки изменения связывания популяций фаговых антител с TNF человека. Проведенное тестирование показало значительное увеличение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-го раунда селекции, в сравнении с сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что указывало на обогащение фаговой популяции антителами, специфичными к TNF.
Из обогащенной библиотеки, полученной в результате третьего раунда биопэннинга, 29 независимых клонов тестировали методом ИФА по способности продуцировать фаговые антитела, связывающие TNF человека. В качестве отрицательного контроля использовали 0.1% раствор Твин-20 в фосфатном буфере, в качестве контроля неспецифического связывания — бактериофаг М13К07, не несущий антител на своей поверхности. Проведенный анализ показал, что фаговые антитела, выделенные из 15 независимых клонов, продемонстрировали сигнал в 5 и более раз превышающий значения такового для бактериофага М13К07 и для отрицательного контроля. Для того чтобы оценить разнообразие отобранных антител, были определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Было показано, что из 15 отобранных фаговых антител, 6 антител (a1, a3, b2, b3, d4 и g1) являлись уникальными (рис. 1).
С помощью базы данных NCBI IgBLAST анализировали аминокислотные последовательности отобранных scFv-антител. Вариабельные домены тяжелых цепей у всех отобранных антител различались и относились к УИ3-семейству, вариабельные домены легких цепей отобранных антител принадлежали к каппа-семейству. Третий
al a3 Ь2 Ь3 d4 gl
al a3 Ь2 Ь3 d4 gl
(а)
CDR1 CDR2
MAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKG
............V. Е.....Т. . .ТА.....TN.W.H..........V. . .R.NTD.S. .Т.....Q.
..R...LQ......К. Е........А.....DD... H____G.........G..WN..TID.....R.
. .Q........RVTR.........S____NLDDHG......V.........DVNWN. .H.G. - S. .R.
.........................A.........................................D
CDR3
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-VK-RSLKGTR----WGQGTLVTSS
. .A.....A.......................DFDFW . VSLDH............V-
. .V. .IM.
. .A. .SA.
.S....................GGGGYYPS. SH-FDF
.S......N...D...F.F.. ,ESR-FGYWFDS----
.....................KDLG-..SSWD.AFDI
.A....................- . ...........
____V-
PRSL.P .M. .V-....4-
al a3 Ь2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.