ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543
ОДНОВРЕМЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АМФЕНИКОЛОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ
С УФ-ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ © 2015 г. В. Г. Амелин*, **, Н. М. Волкова*, **, Н. А. Репин*, **, Т. Б. Никешина*
*Федеральный центр охраны здоровья животных 600901 Владимир, мкр. Юрьевец **Владимирский государственный университет им. Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых 600000 Владимир, ул. Горького, 87 1Е-таИ: amelinvg@mail.ru Поступила в редакцию 31.10.2014 г., после доработки 23.01.2015 г.
Предложен экспрессный, чувствительный, безопасный способ одновременного определения остаточных количеств флорфеникола, тиамфеникола и хлорамфеникола в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием при 228 и 280 нм с использованием сочетания QuEChERS и дисперсионной жидкостно—жидкостной микроэкстракции (ДЖЖМЭ). Установлены оптимальные условия проведения пробоподготовки QuEChERS и ДЖЖМЭ, обеспечивающие достаточное концентрирование и дополнительную очистку экстракта. Степень извлечения составила 64—87% в зависимости от природы матрицы пробы. При выбранных оптимальных условиях диапазоны определяемых содержаний с учетом коэффициента концентрирования, равного 10, составили 0.01—5 мг/кг. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0.09. Продолжительность анализа составляет 1—1.5 ч.
Ключевые слова: флорфеникол, тиамфеникол и хлорамфеникол, пищевые продукты, ВЭЖХ, УФ-детектирование, QuEChERS, дисперсионная жидкостно—жидкостная микроэкстракция.
Б01: 10.7868/80044450215100023
Антибиотики, применяемые для терапевтических целей и для стимуляции роста и развития молодняка животных, в значительных количествах накапливаются в продуктах питания — мясе, молоке, яйцах. Свободные антибиотики в течение небольшого периода времени выводятся из организма животного с продуктами жизнедеятельности — калом, мочой, полученной продукцией (молоко, яйца), а связанные с белками и другими компонентами длительное время сохраняются в организме. Выводимые из организма антибиотики попадают в виде органических удобрений в почву и далее накапливаются в картофеле, овощах и других растительных продуктах питания [1].
Избыточное или неправильное применение антибиотиков в животноводстве неизбежно приводит к накоплению их в основных продуктах питания, создавая угрозу для здоровья человека. Употребление в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, в том числе амфениколов, негативно сказывается на организме человека и нормируется в РФ согласно СанПиН 2.3.2.1078-01. Их содержание в продук-
тах животного происхождения не должно превышать (мг/кг) 0.01 хлорамфеникола (ХАФ), 0.05 тиамфеникола (ТИА), 0.2 флорфеникола (ФЛО) в мясе, 3 в печени, 0.3 в почках, 1 в рыбе садкового разведения.
Существует большое количество доступных методов контроля остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах, среди которых можно выделить капиллярный электрофорез [2—5], ВЭЖХ [6, 7] и масс-спектрометрию [8—10]. Однако эти методы длительны и требуют на стадии пробо-подготовки больших объемов токсичных органических растворителей для экстракции и концентрирования.
В связи со значительным различием в константах кислотности (табл. 1), ХАФ, ТИА и ФЛО редко определяют совместно, поэтому подбор условий для их совместного определения является актуальной и в тоже время сложной задачей.
С 2003 г. для быстрого извлечения пестицидов и очистки экстрактов применяют способ дисперсионной твердофазной экстракции QuEChERS
Таблица 1. Строение и значения амфениколов
(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe — быстрый, простой, дешевый, эффективный, точный и надежный) [11]. Экстракцию целевых компонентов проводят ацетонитрилом в присутствии буферирующих солей. Очистку экстрактов от ли-пидов, жиров и белков осуществляют насыпными сорбентами Bondesil-PSA, C18, графитированной сажей, ионообменниками и их комбинациями. В настоящее время пробоподготовку QuEChERS используют и при определении амфениколов. Однако эти способы не дают возможности совместного определения амфениколов в пищевых продуктах животного происхождения, за исключением молочной продукции [12]. Кроме того, отмечают низкие степени извлечения амфениколов из яиц [13]. Все применяемые варианты QuEChERS не позволяют в должной мере очистить экстракты от матриц и достичь необходимых пределов определения.
Цель настоящей работы заключалась в разработке экологичной, дешевой и экспрессной методики одновременного определения амфениколов в продуктах животного происхождения, включающей совмещение пробоподготовки QuEChERS с дополнительной очисткой экстракта дисперсионной жидкостно—жидкостной микроэкстракцией.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. В работе использовали жидкостной хроматограф с УФ-детектором Flexar (Perkin-Elmer, США). Разделение проводили на колонке (250 х 4.6 мм) SUPELCOSILTMLC-18 (5 мкм) (Sig-ma-Aldrich, США) в режиме изократического элюирования подвижной фазы.
Реактивы. Использовали стандартные образцы амфениколов (хлорамфеникол, флорамфени-кол, тиамфеникол) (Sigma, Германия). Стандартные растворы амфениколов с концентрацией 100.0 мкг/мл готовили в воде с добавлением 0.1 об. % муравьиной кислоты. Использовали ацетонитрил для хроматографии (Merck, Германия), сульфат магния х. ч., хлорид натрия х.ч., натрий лимоннокислый трехзамещенный двойной гидрат х. ч., натрий лимоннокислый двузамещенный полуторный гидрат х. ч., сорбенты Bondesil-PSA (Varian, США) и С18 (Supelco, США), ацетат натрия (Dudley Chemical, Россия), муравьиную кислоту (Pan-reac, Европейский союз), дихлорметан (Panreac, Европейский союз).
Пробоподготовка по методу QuEChERS. Исследуемые пробы измельчали миксером. В пробирку для центрифугирования емк. 50 мл вносили навеску 5.0 г, добавляли 10.0 мл ацетонитрила, 0.1 мл конц.
0 5 10 15 20 25 30
t, мин
Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси тиамфеникола (1), флорфеникола (2) и хлорамфеникола (3) (по 5 мкг/мл).
A, mAU
90
80 70 60 50 40 30 20 10
2
- /V
■{ 3
1 /V
1
НСООН, закрывали пробирку и энергично встряхивали в течение 1 мин. Затем вносили смесь буфе-рирующих солей: 4.0 г безводного М§804, 1.0 г №С1, 1.0 г Ш3С6Н507 ■ 2Н20 и 0.5 г Na2С6Н6О7 ■ • 1.5 Н2О. После внесения солей встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 6000 об/мин, отбирали 7 мл верхней части экстракта и переносили в пробирку для центрифугирования емк. 15 мл, которая содержала смесь сорбентов Вопёе811-Р8А (0.15 г), С18 (0.15 г) и сульфата магния (0.95 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали 10 мин при 2700 об/мин. Дополнительную очистку и концентрирование проводили способом ДЖЖМЭ, используя экстракт в качестве диспергента. Для этого отбирали 1 мл экстракта, вносили в него 450 мкл дихлорметана, вводили полученную смесь в пробирку емк. 15 мл, содержащую 5 мл деионированной воды, встряхивали и воздействовали ультразвуком в течение 4 мин, центрифугировали 10 мин при 2700 об/мин. Отбирали микрошприцем нижний слой экстракта в микрофлакон, упаривали в токе азота досуха, остаток растворяли в 1 мл подвижной фазы (0.1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде) и хроматогра-фировали.
Для характеристики эффективности процесса пробоподготовки рассчитывали коэффициент концентрирования (К) и степень извлечения (Я):
К = Ск/се, Я, % = (СкУк/е0¥0) х 100,
где ск и с0 — концентрация аналита в конечном анализируемом растворе и начальная концентрация аналита в исходной пробе воды, ^к и Уо — объемы конечного анализируемого раствора-концентрата и пробы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве подвижной фазы использовали 0.1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде и ацетонитрил. Варьировали содержание кислоты в подвижной фазе для лучшего разделения амфениколов и повышения чувствительности детектирования. На рис. 1 представлена хроматограмма смеси амфениколов, полученная в оптимальных условиях: температура колонки 55°С, изократическое элюирование, 0.1%-ная муравьиная кислота в смеси вода—ацетонитрил (85 : 15), расход подвижной фазы 1.0 мл/мин, длина волны детектирования для ТИА и ФЛО 228 нм, для ХАФ 280 нм, объем вводимой пробы 20 мкл.
Для извлечения остаточных количеств антибиотиков из пищевых продуктов и очистки экстрактов применяли способ QuEChERS. Выбор количеств MgSO4, адсорбентов Bondesil-PSA и С18 осуществляли по максимальным значениям степеней извлечения амфениколов из реальных объектов; они составили на 5 г пробы 0.9 г MgSO4, по 0.15 г Bondesil-PSA и С18. Экстракт, полученный данным методом, требует концентрирования и во многих случаях дополнительной очистки. Использование ДЖЖМЭ позволило провести дополнительную очистку экстракта и эффективно сконцентрировать пробу.
Выбор природы и объемов диспергента и экс-трагента для ДЖЖМЭ, времени центрифугирования и обработки ультразвуком осуществляли по максимальным значениям степеней извлечения. Для проведения ДЖЖМЭ диспергент (диспергирующий растворитель) должен отвечать следующим требованиям: хорошо растворяться в воде (среде), растворять необходимый объем экстраген-та. Установлено, что в качестве диспергента возможно использовать ацетонитрильный экстракт, полученный в ходе пробоподготовки по методу
R, %
100 80 60 40 20 0
R, % 100
(а)
80 60 40 20 0
ТИА ФЛО ХАФ
Трихлорметан Дихлорметан Тетрахлорметан (б)
lili
0.15
0.30
0.45
0.60
V, мл
R, % 80
60 40 20 0
ТИА ФЛО ХАФ
5
t, мин
Рис. 2. Влияние природы (а) и объема экстрагента (б) на степень извлечения антибиотиков.
РиЕСИЕЯВ. Использование 1 мл экстракта дает наилучшую степень извлечения амфениколов.
В качестве экстрагента исследовали ди-, три- и тетрахлорметан. Максимальные степени извлечения ФЛО, ТИА и ХАФ получены при использовании дихлорметана, а оптимальный объем экстра-
Рис. 3. Влияние продолжительности воздействия ультразвука на степень извлечения амфениколов.
гента составил 450 мкл (рис. 2). Однако в данном случае образуется малоустойчивая эмульсия с довольно крупными каплями экстрагента. Для увеличения времени существования эмульсии и поверхно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.