Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21. № 8, с. 651 - 653
__ ПИСЬМА ________
РЕДАКТОРУ
УДК 5Ш.т.52.057
ОКИСЛЕНИЕ ОКТАДЕКАПЕНТАЕНОВОЙ (1Н:5н-3) КМ СЛОТЫ СОЕВОЙ 15-ЛИПОКСИГЕНАЗОЙ
© 1995 I. Д. В. Куклев, Г. С. Когтева, Н. А. Латышев, В. В. Безуглов*
Институт биоорганичес>с0й химии им. М.М. Шемякина и ТО.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Поступило ! редакцию 0?,]34.95 г. ■ ■
Впервые показано, что СЮРА - (32,62,92,122,152)-октадекапентаеновпя кислота - легко подверга ется ферментативному окислению соевой 15-липоксигеназой с образованием новых оксилиПинов. Первичный продукт перекисного окисления был идентифицирован как (135\32,62.02, 11Е, 1577)-13-гидропероксйМтадекапентаеновая кислота, двум вторичным продуктам была приписана структура (135,32>62,92,ПЯ,152)-13-гадрока10ктаде!<апентаеновой кислоты и (32,62,92,! 1 К)-13-оксотридека• те граеновой кислоты на основании данных ЯМР, УФ и масс-спектрометрии. Было отмечено отсутствие среди продуктов лииоксигеназного окисления 9-региоизомеров и кетодиенов.
Ключевые слова: октадекапентатовая кислота, оксилипины, соевая 15-лш1оксигспаза, 13-гцдро-ксиоктадскапеитаеновая кислота
Природная ООРА. - (ЗZ,6Z,9Z,\2Z^5Z)-oктйJ\e-к а п е н та е т го в а я кислота (Г), - найденная в лшпщах морских организмов [], 2], является максимально ненасыщенной метиленразделенной С18-жирной кислотой нормального строения. ООРА до настоящего времени не рассматривали в качестве предшественников оксилипииов: в литературе отсутствуют данные об окисленных производных ООРА, равно как и о путях ее метаболизма в организме человека й животных. Наличие четырех диал-лильных атомов углерода и аллильного атома в «-положении к карбоксильной группе делают структуру ООРА уникальным и весьма интересным объектом для изучения окислительного метаболизма. Известно, что С18-кислоты - основные полнено вые жирные кислоты высших растений, в последних оксилипины образуются действием различных липоксигеназ. С этой точки зрения было интересно изучить ферментативное окисление ООРА растительной 15-липоксигеназой.
Развивая работы по изучению окисленных производных природных полиеновых жирных кислот [3], мы провели исследование основных продуктов окисления ООРА с помошыо липокси-геназы соевых бобов.
ООРА была синтезирована по методике [4] в количестве более 2 г в виде бесцветного подвижного масла без специфического запаха и вкуса. Чистота ООРА, использованной в ферментатнв-
* Автор для переписки (факс: (095)335-71-03, электронная почта: у .'bii4@ibch.si0bc.msk.su (МетеО).
пых исследованиях, была более по данным ГЖХ-анализа.
Для получения гидропероксида (II, см. схему) 20 мкг соевой !5-липоксигеназы (КФ 1Л8Л1.12. тип I, 130000 ед. акт,./мг белка; Sigma, США) растворяли в 10 мл 0.2 М боратного буфера (pH 9.0) (буфер А), насыщенного кислородом, и прибавляли 200 мкг OD РА в 20 мкл этанола. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при 23°С. Липид-ные продукты экстрагировали с помощью патрона Amp'rep С2 (Amersham, Англия), промывая его последовательно 5 мл воды и 0.1 мл этанола, продукт элюировали 8 мл этанола. УФ-спектр: >w 233 нм (этанол). Масс-спектр FAB (fast atom bombardment, ионизация быстрыми атомами), m/z: 307 [М + Н]\
Альдегид (III) получали по следующей методике: к 500 мл буфера А при перемешивании прибавляли раствор 100 мг ODPA в 2 мл этанола. 15-Липоксигеназу сои (15 мг) растворяли в малом объеме буфера А и прибавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали !5 мин при 22°С, подкисляли конц. НС] до pH 4. Лишщные продукты экстрагировали на колонке с 15 г обращенной фазы С12, промывая ее водой, смесью вода-метанол (80 : 20) и метанолом (по 200 мл). Метанольный алюат, содержавший искомые соединения, упаривали в вакууме, продукты разделяли хроматографией па силикагеле. Выход (3Z.6Z.9Z, 1 iE)-13-оксотридекатетраепОвой кислоты (III) 11.5 мг (14%). При ТСХ на силикагеле Rf 0.12 (гексан-эфир, 1:1). УФ-спектр: Л,.,ал 278 нм (этанол, е 24900), отсутствует тонкая структура.
652 КУКЛЕВ и др.
СООН
(И)
ООН
15-лииоксигеназа
NaBH4
ОН
Схема.
Спектр 'Н-ЯМР (8, м. д.): 2.87 (м, 2Н, Н5), 3.13 (м, 2Н, Н8), 3.17 (м, 2Н, Н2), 5.47 <м, 2Н, Нб, Н7), 5.61 (м, 2Н, НЗ, Н4), 5.96 (м, 1Н, Н9), 6.19 (дд, 1Н, Н12, / 17.0, У 7.1 Гц), 6.30 (м, 1Н, НЮ), 7.48 (дд, 1Н, НИ, У 14.1, У 8 Гц), 9.63 (д, 1Н, Н13,У 8.8 Гц). Масс-спектр (EI*) метоксиимина метилового эфира альдегида (1П), ключевые ионы, т/г (интенсивность, %): 263 ((W, U), 150 {[М - СН2СН=СНСН2СООМе]+, 100). Из смеси продуктов реакции были также выделены: 40 мг ODPA и 1 мг (3Z,6Z,9Z,11E.15Z)-13-гидроксиоктадекапентаеновой кислоты (IV, см. схему).
Гидроксикислоту (IV) получали так же, как альдегид (III), но к раствору фермента в буфере А сначала прибавляли раствор 30 мг NaBH4 в 5 мл буфера A, a 3á'reM ODPA, перемешивали 20 мин при 22°С. Реакционную смесь обрабатывали так, как описано выше. Выход (3Z,6Z,9Z,11£,15Z)-13-гидроксиоктадекапентаеновой кислоты (IV) 28 мг (25.2%). RfQA6 (гексан-эфир, 1 : 1). УФ-спектр: Хтм 234 нм (е 29600, этанол). [o]D + 10.0°. 'Н-ЯМР-спектр (6, м. д.): 1.02 (т, ЗН, HI 8), 2.08 (м, 2Н, Н17), 2.35 (м, 2Н, Н14), 2.85 (м, 2Н, Н5), 2.96 (м, 2Н, Н8), 3.17 (м, 2Н, Н2), 4.28 (дт, 1Н, Н13, / 9.0, / 5.5 Гц), 5.40 (м, 2Н, Н15, Н16), 5.45 (дт, 1Н, Н9, /11.0, Г 7.0 Гц), 5.39 (м, 2Н, Нб, Н7), 5.61 (м, 2Н, НЗ, Н4), 5.73 (дд, 1Н.Н12,/ 15.0,7'5.5 Гц), 6.01 (т, 1Н.Н10, /11.0 Гц), 6.58 (дд, 1Н, Н11, / 15.0, /'11.0 Гц). Масс-спектр (EI) Bu'Me2Si-npoi!3BOflHoro метилового эфира, ключевые ионы, miz (интенсивность, %): 418 ([М]+, 3), 349 ([М- EtCH=CHCH]\ 69), 265 ([М - МеООССН2СН= СНСН2СН=СНСН2]+, 24).
* Electron impact (электронный удар).
Macc-cneKip (El) Ви'Ме^ьпроизводного метилового эфира, гидрированного над Pt02> ключевые ионы, m/z (интенсивность, %): 428 ([М]+, 0.1), 357 ([М - С5НИ]+, 100), 339 ([М - Bu(-MeOH]+, 22), 215 {[М - (СН2)иСООМе]+, 73). Из смеси продуктов реакции также выделили 48 мг ODPA. Величина и знак оптической активности полученной нами гидроксикислоты (IV) и известная высокая энан-тиоселективность соевой липоксигеназы [5] позволили идентифицировать гидроксикислоту (IV) как 135-энантиомер.
Таким образом, нами впервые установлено, что ODPA способна окисляться соевой 15-липок-сигеназой. Основной продукт липоксигеназной реакции - 13-гидропероксикислота (II), которая в дальнейшем превращается в альдегидокислоту (III), а под действием восстановителей может быть превращена в гидроксикислоту (IV). Альде-гидокислота (III) является преобладающим конечным продуктом в случае, когда липоксигеназ-ная реакция проводится при недостатке кислорода в инкубационной среде и концентрации фермента, превышающей 10 мкг/мл. Следует отметить, что ни в одном из наших экспериментов мы не наблюдали образования 9-гидр(пер)окси-изомера в составе продуктов липоксигеназного окисления ODPA; этот факт ставит исследуемую кислоту на особое место в ряду других С18-жир-ных кислот [6]. Необходимо также указать на факт отсутствия среди вторичных продуктов окисления (3Z,6Z,9Z,11Е, 152)-9-океооктадекапента-еновой кислоты, в то время как для пиноленовой кислоты и ряда других жирных кислот наличие кетодиеновых соединений в спектре продуктов окисления липоксигеназой - распространенное явление [3, 6].
ОКИСЛЕНИЕ ОКТАДЕКАПЕНТАЕНОВОЙ (18:5и-3) КИСЛОТЫ
Ö53
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Асктап R.G. // Marine Biogenic Lipids, Fats, and Oils. V. 1 / Ed. R.G. Ackman. Boca Raton: CRC Press, 1989. P. 118-119.
2. Kuklev D.V., Aizdaicher N.A.. imbs А.В., Bezuglov V.V., Lalyshev N.A. // Phytochemistrv. 1992. V. 31. P. 2401 - 2403.
3. Куклев Д.В., ИмбсА.Б., Лонг Ф.К., Беэуглов В.В. // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 1238 - 1240.
4. Куклев Д.В., Латышев H.A., Безуглов В.В. // Био-орган. химия. 1991. Т. 17. С. 14331436.
5. Hamberg М.. Samuelsson В. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 5329 - 5335.
6. Sanz L.C., Perez A.G., Rios J.J., Ollas J.M. // J. Agrie. Food Chem. 1993, V. 41. P. 696 - 699.
Oxidation of Octadecapentaenoic (18:5/i-3) Acid with Soybean 15-Lypoxygenase
D. V. Kuklev, G. S. Kogteva, N. A. Latyshev, and V. V. Bezuglov1
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117871 Russia
Abstract - it is shown for the first time that (3Z,6Z,9Z, 12Z, 15Z)-octadecapentaenoic acid (ODPA) is readily oxidized with soybean 15-lypoxygenase to form new oxylipins. Based on NMR, UV, and mass-spectrometry, the primary peroxidation product was identified as (J35',3Z,6Z,9Z,lli',15Z)-I3-hydroperoxyoctadecapen-tacnoic acid, and two secondary products were identified as (135,3Z,6Z,9Z, 11 £,15Z)-13-hydroxyoctadecapentaenoic and (3Z,6Z,9Z,1 l£)-13-oxotridecatetraenoic acids. The lipoxygenase oxidation products were found to contain no 9-regioisomers and ketodienes.
Key words: octadecapentaenoic acid, oxylipin, soybean 15-lipoxygenase, 13-hydroxyoctadecapentaenoic acid.
1 To whom correspondence should be addressed; fax: (095)335-7103, e-mail: vvbez@ibch.siobc.msk.su.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.