ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2015, том 49, № 1, с. 76-80
- ПЛАЗМОХИМИЯ =
УДК 544.55
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В РАСТВОРЕ АЛЬБУМИНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМЫ ИСКРОВОГО РАЗРЯДА © 2015 г. И. М. Пискарев*, И. П. Иванова**, ***, С. В. Трофимова**, ***, О. Е. Бурхина***
*Научно-исследовательский институт ядерной физики им. Д.В. Скобельцына Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова 119234, Москва, Воробьевы горы Е-таИ: i.m.piskarev@gmail.com **Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития
603005, Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1 ***Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского — Национальный исследовательский университет 603950, Нижний Новгород, просп. Гагарина, 23 Поступила в редакцию 16.07.2014 г. В окончательном виде 18.08.2014 г.
Излучением плазмы искрового электрического разряда на воздухе (ИР) и ртутной УФ-лампы низкого давления (УФ) обрабатывали 5% водный раствор альбумина и оценивали концентрацию —$Н-групп. В необработанном растворе на 1 молекулу альбумина приходится в среднем около 0.2 групп —$Н. При обработке альбумина ИР в течение 15 мин концентрация —$Н-групп возрастает в ~2 раза и далее не меняется. После обработки УФ-излучением концентрация —$Н-групп монотонно растет и за 30 мин увеличивается в ~7 раз. Увеличение концентрации —$Н-групп связано с восстановлением дисуль-фидных связей. Восстановительными свойствами при ИР могут обладать продукты распада перок-сиазотистой кислоты.
БО1: 10.7868/80023119715010093
Пероксинитрит и пероксиазотистая кислота играют большую роль в биохимических процессах, происходящих в живом организме [1]. Для понимания механизмов действия различных физических факторов на клетку и организм в целом огромное значение играет направленность окислительно-восстановительных процессов. Растворы белков являются удобной моделью для подобных исследований. Установлено, что под действием излучения плазмы искрового электрического разряда на воздухе в водных растворах образуется димер пероксиазотистой кислоты и пероксинит-рита ОМООН.ОМОО- [2]. Инициаторами окисления под действием плазмы искрового разряда
являются радикалы НО2 [3]. Восстановление может происходить через продукты распада димера и пероксиазотистой кислоты [4]. Образование комплекса, содержащего пероксинитрит и перок-сиазотистую кислоту, при флэш-фотолизе отмечалось также в [5]. Принято считать, что перокси-нитрит и пероксиазотистая кислота обладают только сильно выраженными окислительными свойствами [1, 6]. Однако окислительными и восстановительными свойствами обладают не сам пероксинитрит или пероксиазотистая кислота, а
промежуточные продукты, через которые они распадаются [6]. Так как накопление -8Н-групп в растворах белков связано с восстановлением ди-сульфидных связей, а расходование -8Н-групп — с их окислением, то наблюдение -8Н-групп позволяет оценить роль восстановления и окисления при действии физических факторов. Поэтому в данной работе исследовалось изменение концентрации — 8Н-групп в альбумине под действием излучения плазмы искрового разряда на воздухе и УФ-излучения ртутной лампы.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Использовались два источника излучения. Первый источник — генератор излучения плазмы искрового разряда на воздухе ИР-10 [7]. Энергия импульса 5.9 х 10-2 Дж, длительность переднего фронта 50 нс, полная длительность импульса 100 мкс, частота повторения импульсов 10 Гц. Плотность потока энергии УФ-С диапазона во время импульса (100 мкс, 10 Гц) на расстоянии 1 см от электродов (энергия в импульсе) составляла 2 Дж см-2 с-1. Средняя плотность потока энергии излучения на том же расстоянии (2 ± 0.3) х 10-3 Дж см-2 с-1. Поток фотонов УФ-С диапазона (1.26 ± 0.3) х
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В РАСТВОРЕ АЛЬБУМИНА
77
х 10-10 моль см-2 с-1. Светимость во всем диапазоне длин волн 230 люкс. Максимум спектра излучения при длине волны 220 нм. Второй источник излучения — ртутная лампа низкого давления ДБК-9 (9 Вт, X = 253.7 нм). Согласно техническому описанию, поток энергии излучения составлял 2.6 х 10—2 Дж см-2 с-1 на расстоянии 3 см от лампы, поток фотонов 5.4 х 10-8 моль см-2 с-1. Светимость 2400 люкс. Поток фотонов УФ-лам-пы ДБК-9 (X = 253.7 м) превышал в 430 раз поток фотонов УФ-С диапазона генератора излучения плазмы ИР-10 [3].
Концентрация -SH-групп определялась с реактивом Эллмана: 5,5-дитио-бмс-(2-нитробен-зойная кислота), 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) или DTNB [8]. Использовались фосфатный буфер: 0.1 M Na2HPO4, pH 8; денатурирующий буфер: 7 M мочевина в 0.1 M Na2HPO4, pH 8-8.5; раствор реагента Эллмана; (4 мг DTNB)/(мл фосфатного буфера); 5% водный раствор альбумина (7.7 х 10-4 M) как образец.
Измерения проводили следующим образом. Сначала к 3 мл денатурирующего буфера добавляли 100 мкл раствора Эллмана и 100 мкл пробы. Перемешивали, инкубировали в течение 5 мин и фотометрировали против раствора денатурирующего буфера при X = 412 нм (^sampie). Оптическую плотность определяли спектрофотометром СФ-26 (Россия), толщина кюветы 10 мм. Далее измеряли оптическую плотность при той же длине волны для контрольного раствора: 3 мл денатурирующего раствора, 100 мкл фосфатного буфера и 100 мкл раствора Эллмана (Аотав). Значение оптической плотности, соответствующей количеству -SH-групп в исследуемой пробе, равно: ^sh = Aampie - ^dtnb. Концентрацию -SH-групп определяли исходя из коэффициента экстинкции 13700 М-1 см-1 [8].
Обработку раствора альбумина излучением ИР проводили в стерильной чашке Петри диаметром 40 мм. Объем образца 4 мл. Расстояние от поверхности жидкости до электродов разрядника 1 см. Обработку раствора УФ-излучением ртутной лампы проводили в тех же чашках Петри. Расстояние от поверхности жидкости до лампы 3 см. Время обработки в обоих случаях 0-30 мин. Все эксперименты повторяли 5 раз.
Величину рН измеряли прибором "Эксперт-001" (фирма "Эконикс", Россия). Использовались химически чистые реактивы, дистиллированная вода (рН 5.9), бычий альбумин, фракция V модифицированная, М = 69 кДа (фирма "БиоВест", Россия).
Статистический анализ результатов проводился с помощью программ "Excel" и "Statistica v. 6.0". Результаты эксперимента представлены в таблице как M± m, где M- среднее арифметическое, m -ошибка среднего.
Таблица 1. Средняя концентрация —$Н-групп для образцов водного раствора альбумина (7.7 х 10 М) и значения рН до и после обработки излучением плазмы искрового разряда (ИР) и ртутной лампы (УФ) в течение времени ?, с
Время, t, с [SH]/[Alb] (моль SH)/(моль Alb) pH
ИР УФ ИР УФ
0 0.22 ± 0.03 0.17 ± 0.03 7.1 ± 0.1 7.1 ± 0.1
5 0.21 ± 0.03 0.19 ± 0.03 7.1 ± 0.1 7.1 ± 0.1
10 0.21 ± 0.03 0.2 ± 0.03 7.0 ± 0.1 7.1 ± 0.1
30 0.25 ± 0.03 0.21 ± 0.03 7.0 ± 0.1 7.1 ± 0.1
60 0.26 ± 0.03 0.24 ± 0.03 6.8 ± 0.1 7.0 ± 0.1
300 0.28 ± 0.04 0.49 ± 0.1 6.7 ± 0.1 7.2 ± 0.1
600 0.31 ± 0.04 0.77 ± 0.1 6.2 ± 0.1 7.1 ± 0.1
900 0.39 ± 0.04 1.01 ± 0.1 5.8 ± 0.1 7.2 ± 0.1
1200 0.39 ± 0.04 1.23 ± 0.1 5.3 ± 0.1 7.0 ± 0.1
1800 0.36 ± 0.04 1.5 ± 0.1 5.0 ± 0.1 7.0 ± 0.1
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА
Среднее количество —8Н-групп, отнесенных к одной молекуле альбумина, и рН раствора в исходном образце и обработанном излучением разных источников: (1) плазмы искрового разряда на воздухе, (2) ртутной лампы низкого давления — приведены в табл. 1.
В исходном образце альбумина содержится в среднем около 0.2 групп —8Н на 1 молекулу альбумина, что соответствует техническим характеристикам реактива. В обоих случаях под действием излучения количество — 8Н-групп в образцах увеличивается в ~2 раза при облучении ИР и в 7—8 раз при облучении УФ. Под действием ИР концентрация —8Н-групп за время обработки 900 с достигает стационарного значения, далее практически не меняется, в то время как под действием УФ концентрация —8Н-групп монотонно возрастает. Величина рН раствора альбумина при обработке ИР уменьшается, а при обработке УФ остается неизменной.
ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе процессов с участием перокси-нитрита обычно принимают во внимание окисление [1, 6]. Окислительными свойствами обладают не пероксинитрит или пероксиазотистая кислота, а промежуточные продукты, через которые они распадаются. Основной путь изомеризации пе-роксинитрита связан с образованием в конечном
состоянии азотной кислоты: ОМОО— ^ N0—. Такой путь наблюдался в [2] при образовании пе-роксинитрита под действием ИР. Этот путь под-
Таблица 2. Энергии разрыва С—Н, 8—0—, 8-Н и связей [15, 16]. Р — протеин
Связь Энергия, ккал/моль
1 С-С-Н 1 91 ± 1.1
1 С=С-Н 87 ± 1.2
Р8-0- 124 ± 1.1
Р8-Н 82.3 ± 0.8
Р8-8Р 99.8 ± 1.3
Н202 — Н' + Н0^ 88 ± 2
20М00- + Н+ ^ 0М00Н...0М00-.
(1)
Он претерпевает перегруппировку через циклическое переходное состояние:
0М00Н...0М00-
Ионы N0-,
^ 02 + N0^ + НМ02.
(2)
где ох — окислитель. Уменьшение рН в процессе обработки ИР (табл. 1) свидетельствует об образовании в конечном состоянии азотной кислоты — продукта распада пероксинитрита и пероксиазо-тистой кислоты (р^а = 6.8) [2]. Под действием УФ-излучения кислота не образуется. Перокси-азотистая кислота — сильный одноэлектронный и двухэлектронный окислитель. В случае двухэлек-тронного переноса продуктом реакции является азотистая кислота [12].
(5)
разумевает возможность проявления восстановительных свойств, так как степень окисления азота в пероксинитрите +3, а в азотной кислоте +5, т.е. в этом процессе субстрату могут быть переданы два электрона. Восстановление стабильного свободного радикала ДФПГ* под действием ИР наблюдалось в [4]. Возможность осуществления восстановления зависит от конкретного пути изомеризации. Восстановительными свойствами могут обладать продукты распада пероксинитрита ионы N02.
В [9] анализируются пути распада пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты. Один из путей связан с образованием и последующим распадом аддукта (димера) 0М00Н...0М00-. Димер образуется в кислой среде:
>2 и азотистая кислота, на которые распадается димер, могут проявлять восстановительные свойства. В [2] показана возможность образования
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.