ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 570-577
УДК 579.24
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ СТАТУС ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫХ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia Upolytica ПРИ АДАПТАЦИИ К рН-СТРЕССУ
© 2015 г. В. Ю. Секова*, Н. Н. Гесслер*, Е. П. Исакова*, А. Н. Антипов*, Д. И. Дергачева**, Ю. И. Дерябина*, Е. В. Трубникова***
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 **Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, Москва, 119571
***Курский государственный университет, Курск, 305000 e-mail: yul_der@mail.ru Поступила в редакцию 15.06.2015 г.
Исследованы изменения активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаз, СОД, и каталаз), а также уровня активных форм кислорода в дрожжевых клетках Yarrowia lipolytica при выращивании на средах с различными значениями рН (4.5, 5.5 и 9.0). Показано, что увеличение уровня активных форм кислорода в клетках происходило как в кислых, так и в щелочных условиях. Рост клеток в экстремальных условиях сопровождался значительным увеличением активности СОД (в 2.5 раза в кислых и в 4 раза в щелочных условиях), при этом активность каталазы не изменялась. Изучение электрофоретического профиля каталаз показало присутствие трех изоформ, различающихся по устойчивости к ингибиторам этих ферментов. Электрофоретический профиль СОД и ин-гибиторный анализ выявил, наряду с присутствием Cu, Zn-СОД, наличие двух других форм, предположительно митохондриального происхождения. Обсуждается роль СОД в рН-адаптации экстре-мофильных дрожжей Y. lipolytica.
Ключевые слова: рН-стресс, антиоксидантные ферменты, супероксиддисмутаза, каталаза, активные формы кислорода, Yarrowia lipolytica.
DOI: 10.7868/S0555109915060136
Экстремофильный вид дрожжей Уагго^1а И-ро1уИса является частым объектом исследования в различных отраслях науки и промышленности в силу уникальности его физиолого-биохимиче-ских свойств [1]. Микроорганизм способен эффективно и быстро утилизировать разнообразные доступные субстраты, например, нефтяные парафины, неочищенные гидролизаты биомассы, промышленные стоки и т.п., что позволяет использовать его в качестве перспективной модели при разработке очистки стоков, водной и почвенной биоремедиации, конверсии органических поллютантов. Кроме того, дрожжи У. Иро1уИса обладают способностью к секреции белка во внешнюю среду. Высокая метаболическая активность и устойчивость У. Иро1уИса к химическим стрессорам делает возможным использование этого объекта для продукции большого количества органических соединений, в том числе, органических кислот [2]. И наконец, этот уникальный вид дрожжей является прекрасной экспериментальной моделью для исследования диморфного перехода между дрожжеподобным состоянием и мицели-альной формой у грибов, что может быть исполь-
зовано для поиска возможных лекарств против патогенных микроорганизмов растений, животных и человека [3, 4].
Характерной чертой дрожжей У. ИроШка, вызывающей особый интерес исследователей к этому организму, является их способность не только выдерживать щелочной стресс, но и эффективно развиваться на средах с pH до 9.5 [5]. Считают, что в основе адаптации дрожжей к высоким значениям рН окружающей среды лежат кальцинейрин- и Кгт-101-зависимые сигнальные пути. Установлено, что кальцинейрин-зависимая система активируется рядом генов, реагирующих на защелачива-ние среды, через транскрипционный фактор Сге1р [6]. Мутанты У. ИроШка по генам пш9 обладают измененным фенотипом и не способны к адаптации (рН-ответу), в то время как мутанты У1Кгт23р характеризуются значительным рН- ответом [6]. Показано также участие №+-зависимой фосфат-транспортной системы плазматической мембраны в адаптации к щелочному стрессу [7]. Все описанные механизмы обеспечивают запуск экстренного ответа на стресс, приводя лишь к краткосрочному выживанию клетки в условиях высоких рН. Одна-
ко У. 11ро1уИса хорошо растет на средах с рН до 9.5, при этом механизмы, обеспечивающие выживание микроорганизма в этих условиях, остаются до конца не изученными. С другой стороны, как и другие виды дрожжей, У. Ыро1уИса активно развивается и в кислой среде, в том числе при экстремально низких значениях рН 3-4 [8]. Таким образом, молекулярные механизмы амбивалентной рН-адаптации у У. Иро1уИса, сопряженной с общей экстремофильностью, в частности, галотоле-рантностью, остаются не ясными.
Известно, что поддержание нативной кон-формации мембранных структур, основанной на липидном гомеостазе, является основным адаптивным свойством дрожжевых организмов, подвергающихся различного рода стрессовым воздействиям [9]. Индуцированное активными формами кислорода (АФК) окисление ненасыщенных липидов клеточных мембран (перекисное окисление липи-дов) обусловливает, в свою очередь изменения в мембранах, приводящие к нарушению физиологии клетки, вплоть до ее гибели [10]. Кроме того, отмечено, что стрессовые воздействия различной природы (тепловой шок, истощение по субстрату, солевой, осмотический и собственно окислительный стрессы) приводят к ингибированию белкового синтеза, в частности, на стадии элонгации и терми-нации, что также отражается на мембранных функциях дрожжевой клетки [11].
Наряду с этим известно, что высокая адаптивная способность дрожжей и грибов связана с наличием целого комплекса антиоксидантной защиты, препятствующего развитию в клетках окислительного стресса [12, 13]. Первая линия защиты включает каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) [13, 14]. В клетках классических аскомицетов Бас-сагошусвз сerevisiae описаны 2 формы СОД — Си, Zn-зависимая цитоплазматическая СОД (СОД1) и Мп-зависимая СОД (СОД2), локализованная в митохондриальном матриксе [15]. Считается, что фракция СОД1 локализована в межмембранном пространстве митохондрий. Обе изоформы играют важную роль в детоксикации супероксидных
анион-радикалов (О-'), генерируемых в дыхательной цепи митохондрий и диффундирующих в межмембранное пространство [16]. Важная функция в защите клеток дрожжей от внешних воздействий, как считают, принадлежит СОД1. Так, показано, что мутанты S. сerevisiae по СОД1 гиперчувстви-
тельны к О-', генерируемому в дыхательной цепи, и не способны расти в аэробных условиях, либо отличаются слабым ростом и потерей жизнеспособности в стационарной фазе, в то время как СОД2-мутанты не проявляют признаков гиперчувствительности к экзогенному окислительному стрессу [17, 18]. Ферментами, находящимися в непосредственном взаимодействии с СОД, явля-
ются каталазы [13], которые восстанавливают Н2О2 при участии гемовых групп, образующих комплекс с полипептидом. В дрожжевых клетках существуют две изоформы каталаз — локализованная в пероксисомах и локализованная в цито-золе [14]. Кроме того, в клетках дрожжей найдены целый ряд низкомолекулярных соединений, способных дезактивировать кислородные радикалы и поддерживать редокс-баланс [14].
Цель работы — анализ динамики продукции АФК и изменения антиоксидантного статуса экст-ремофильного штамма У. lipolytica в условиях адаптации к экстремальным значениям рН в сравнении с аналогичными характеристиками мезофиль-ного штамма Endomyces magnusii.
МЕТОДИКА
Объекты исследования и условия культивирования дрожжей. В работе использовали штаммы экс-тремофильного вида дрожжей Y. lipolytica W 29, полученного из CIRM-Levures collection (Франция), и мезофильного вида дрожжеподобных грибов Endomyces magnusii, ВКМ Y-261. Дрожжи Y. lipoly-tica культивировали на минимальной полусинтетической среде с глицерином (0.6—1%) в качестве основного источника углерода, при рН 4.0, 5.5 и 9.0, как описано в работе [19]. Биомассу дрожжей собирали на стадии стационарной фазы роста (24 ч), что соответствовало величине оптической плотности (ОП) суспензии клеток при 590 нм 9.0-10.0 ед.
Клетки дрожжей E. magnusii, штамм ВКМ Y-261, выращивали на полусинтетической среде с глицерином (0.6-1%) в качестве основного источника углерода, как описано в работе [20]. Культивирование дрожжей осуществляли при рН 5.6-5.8. Биомассу собирали на стадии стационарной фазы роста (24 ч), что соответствовало величине ОП суспензии клеток при 590 нм 4.0-4.5 ед.
Приготовление клеточных гомогенатов. Клетки дрожжей отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, дважды отмывали охлажденной водой, суспендировали в соотношении 1 : 1 (г/мл) в среде следующего состава: MES -10 мМ, сорбит - 0.5 М, манит - 0.5 М, ЭДТА -5 мМ, фенил-метил сульфонил фторид, ФМСО -0.5, pH 6.5. Клетки дрожжей разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе (MSE, "Farmacia", Швеция) в течение 2 мин (4 цикла по 30 с, 30 с перерывом) при +4-0°С. Полученный гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мин. Для исследований использовали супернатант.
Определение каталазной активности. Суммарную каталазную активность определяли по скорости расщепления пероксида водорода (при ОП240) и выражали в микромолях расщепленного H2O2 в
1 2 3 4 1 2 3 4 5
Рис. 1. Активность СОД (а, ед./мг белка клеточного экстракта) в экстрактах клеток Y. lipolytica W29 (1—3), выращенных при различных рН (4.0, 5.5 и 9.0 соответственно), и Е. magnusiiпри рН 5.6 (4):
б — электрофоретические профили активности СОД клеточных экстрактов: 1 — Cu, Zn-СОД из эритроцитов быка (молекулярная масса ~32.5 к Да); 2, 3, 4 — гомогенаты клеток Y. lipolytica, выращенных при рН 4.0, 5.5 и 9.0 соответственно; 5 — гомогенат клеток Е. magnusii, выращенных при рН 5.6. Стрелками указана активность СОД.
мин на 1 мг белка [20]. В качестве блокатора ка-талазной активности использовали аминотриа-зол (АТЗ).
Определение активности СОД. Активность СОД определяли непрямым методом, измеряя ингиби-рование автоокисления кверцетина при ОП^ как описано в работе [21]. Кверцетин автоокисляется в щелочных условиях (рН 10.0) с выделением О-' в качестве побочного продукта реакции и разрушением хромофора с максимумом поглощения при 406 нм. Исследование проводили в 20 мМ К-фосфатном буфере, содержащем 0.1 мМ ЭДТА, рН 7.8, добавляли тетраметилэтилендиамин (ТМДА) до рН 10.0—10.2. Затем к реакционную смесь вносили 10 мкл гомогената, разведенного 1 : 10, или при высокой активности 1 : 100. Реакцию за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.