БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2005, том 31, № 5, с. 358-362
УДК 577.1:577.41 БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС, ИНДУЦИРУЕМЫЙ КАДМИЕМ, В ТКАНЯХ ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА MODIOLUS MODIOLUS
© 2005 г. Н. В. Довженко, А. В. Куриленко, Н. Н. Бельчева, В. П. Челомин
Тихоокеанский океанологический институт ДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: nadezhda@ocean.poi.dvo.ru
Статья принята к печати 4.03.2005 г.
С позиции универсальности механизма свободно-радикального окисления рассмотрены характерные черты развития окислительного стресса у морского двустворчатого моллюска Modiolus modiolus при воздействии кадмия. В ходе модельных экспериментов выявлены особенности кинетики аккумуляции кадмия тканями моллюска. Показано, что процесс аккумуляции кадмия сопровождается снижением способности биологической системы "тушить" радикалы кислорода и накоплением продуктов окислительной деструкции липидов (малонового диаль-дегида и липофусциноподобных веществ). Высказано предположение, что кадмий индуцирует окислительный стресс в тканях морского моллюска через дезорганизацию антиоксидантной системы. Предлагается рассматривать индекс антирадикальной активности в качестве интегрального биохимического маркера для оценки и прогнозирования экологических последствий антропогенного воздействия на морские экосистемы.
Ключевые слова: окислительный стресс, аккумуляция кадмия, интегральная антирадикальная активность, оксирадикалы, перекисное окисление липидов.
Cadmium-induced oxidative stress in the bivalve Modiolus modiolus. N. V. Dovzhenko, A. V. Kurilenko, N. N. Belcheva, V. P. Chelomin (Pacific Oceanological Institute, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041)
Cadmium-induced oxidative stress in the bivalve Modiolus modiolus is studied from the standpoint of the universality of the mechanism of free-radical oxidation. The kinetics of cadmium accumulation by bivalve was revealed in laboratory experiment. Gills accumulated higher Cd levels than digestive gland. In the process of cadmium accumulation, there was an increase in lipid peroxidation products (malondialdehyde and lipofuscin) and a reduction in total oxyradical scavenging capacity (TOSC). Cadmium induces the oxidative stress in molluskan tissues through the damage of the anti-oxidation system. Thus, TOSC can provide a useful biochemical indicator of early pathological changes in the cell or the organism, as well as environmental effects of heavy metal pollution. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2005, vol. 31, no. 5, pp. 358-362).
Key words: oxidative stress, accumulation of cadmium, total oxyradical scavenging capacity, oxyradicals, lipid peroxidation.
Уникальная способность двустворчатых моллюсков извлекать из морской воды и концентрировать в органах и тканях высокотоксичный кадмий вызывает повышенный интерес у исследователей. Аккумуляция кадмия может быть причиной дезорганизации разнообразных метаболических процессов как в самом организме-концентраторе, так и в организмах более высоких трофических уровней, составляющих пищевую цепь. Кадмий является типичным политропным химическим агентом, способным взаимодействовать с множественными структурами клетки и вызывать спектр негативных биохимических сдвигов: от ингибирования активности отдельных ферментов и ферментативных ансамблей до повреждения мембранных структур (Viarengo, 1989; Wright, 1995; Canesi et al., 1998; Чело-мин и др., 1998).
С экотоксикологической точки зрения особый интерес представляет способность тяжелых металлов индуцировать окислительный стресс (Regoli, Principato, 1995; Stohs, Bagchi, 1995; Torres et al., 2002), который рассматривается в качестве ведущего патогенетического механизма дезорганизации клеточного метаболизма
(Sies, 1991; Storey, 1996). Согласно этим представлениям, независимо от конкретного механизма действия чужеродного химического агента, его вмешательство в окислительный метаболизм прямо или косвенно сопряжено с усилением генерации высокореакционных радикалов кислорода (оксирадикалов). Возникший дисбаланс между про- и антиокислительными системами приводит к накоплению продуктов окисления основных классов макромолекул, включая липиды, белки и нуклеиновые кислоты, в результате чего в клетке может развиваться патологический (деструктивный) процесс, получивший в литературе название окислительного стресса (Sies, 1991; Storey, 1996). Однако прямых экспериментальных данных, подтверждающих способность кадмия нарушать равновесие между про- и анти-оксидантной системами и вызывать окислительный стресс в тканях водных беспозвоночных, в частности моллюсков, практически нет. Вместе с тем, в ходе натурных и лабораторных исследований отмечены изменения в содержании низкомолекулярных антиоксидан-тов или активности антиоксидантных ферментов у моллюсков (Челомин и др., 1998; Regoli et al., 1998;
Nasci et al., 1999). Этот подход, хотя обычно и используется для выявления специфических взаимосвязей между различными стрессорами и индивидуальными ан-тиоксидантами, не позволяет однозначно оценить степень развития окислительного стресса в биологической системе (Regoli et al., 2002).
Более объективную информацию о состоянии защитного потенциала биологической системы дает новый аналитический метод, названный авторами как метод определения интегральной антирадикальной активности (ИАА) биологических образцов (Regoli, Winston, 1998; Regoli et al., 1998, 2000). Принимая во внимание важное значение показателей окислительного стресса при оценке и прогнозировании экологических последствий воздействия кадмия на морские экосистемы, мы исследовали влияние аккумуляции этого металла на интегральную активность антирадикальной системы и образование продуктов окисления мембранных липидов в тканях морского двустворчатого моллюска Modiolus modiolus.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали взрослых особей двустворчатого моллюска Modiolus modiolus, собранных в июле 2003 г. в зал. Петра Великого вблизи о-ва Рейнеке (Японское море). Мо-диолусов, отобранных по размеру (7-10 см), перед опытами выдерживали в 140-литровых аквариумах не менее 7 сут. Затем экспериментальных моллюсков разделили на 2 группы и содержали в течение 3 нед. в 100-литровых аквариумах с морской водой и постоянной аэрацией при температуре 18-20°С. В аквариумы с экспериментальной группой животных добавляли раствор CdCl2 до концентрации 100 мкг/л. Воду в аквариумах меняли через сутки. Контрольную группу моллюсков содержали в таких же условиях, что и экспериментальную, но без добавления соли металла. Всего проведено четыре серии экспериментов.
Через 3, 7, 10, 14, 17 и 21 сут из экспериментальной группы отбирали по 5 экз. моллюсков для определения содержания кадмия, продуктов перекисного окисления липидов: малонового диальдегида (МДА) и оснований Шиффа и уровня интегральной антирадикальной активности в жабрах и пищеварительной железе.
Для определения содержания белка в гомогенатах тканей использовали метод на основе адсорбции бромфенолово-го синего (Greenberg, Gaddock, 1982). Калибровочные кривые строили по растворам бычьего сывороточного альбумина, концентрацию которого рассчитывали по коэффициенту молярной экстинции. Содержание МДА определяли в гомогена-тах тканей (Buege, Aust, 1978) по цветной реакции с 2-тиобар-битуровой кислотой. Для предотвращения пероксидации ли-пидов в процессе определения МДА в пробы вводили спирто-вый раствор ионола до конечной концентрации 5 мМ. Для расчетов содержания МДА использовали коэффициент молярной экстинции 1.56 х 105/см/М. Уровень флуоресцирующих продуктов (типа оснований Шиффа) определяли спек-трофлуориметрически (Hitachi MPF-4) при длинах волн возбуждения 360 нм и флуоресценции 430 нм после экстракции смесью растворителей (эфир-этанол, 1 : 3 об/об) (Shimasaki et al., 1988). Относительное содержание этих соединений выражали в условных единицах в расчете на миллиграмм белка (относительно флуоресценции раствора 1 мкмоль/мл хинин-сульфата в 0.1 Н H2SO4).
При определении интегральной антирадикальной активности тканей использовали подход, предложенный Уин-стоном с соавторами (Winston et al., 1998), с некоторыми собственными модификациями, суть которых сводится к способу регистрации гидроксильных радикалов (OH). Вместо нестабильного реактива а-кето-у-метиолмасляной кислоты в качестве акцептора гидроксильного радикала мы использовали 2-оксибензойную кислоту (салициловую кислоту), а продукт ее окисления - 2,4-дигидроксибензойную кислоту (2,4-ДГБК) определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Генерацию гидроксильных радикалов осуществляли с помощью реакции Хабера-Вейса в системе (1.0 мл), содержащей 2 мкМ FeCl3, 4 мкМ ЭДТА и 200 мкМ аскорбиновой кислоты, в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.5, в присутствии 0.7 мМ салициловой кислоты. Реакцию запускали добавлением ионов Fe3+, полученную смесь инкубировали в течение 60 мин при 35°С. Образовавшиеся гидроксильные радикалы окисляли салициловую кислоту до 2,4-ДГБК (контрольные образцы). При добавлении в инкубационную смесь гомогена-тов тканей модиолуса, содержащих низкомолекулярные анти-оксиданты ("тушители" гидроксильных радикалов), уровень 2,4-ДГБК снижался пропорционально внесенному количеству гомогената (10-60 мкг белка) (исследуемые образцы). Интегральную антирадикальную активность рассчитывали по формуле:
ИАА = (ИО/КО х 100) - 100,
где ИО и КО - количество продукта окисления салициловой кислоты 2,4-ДГБК в исследуемом и контрольном образцах соответственно. Все значения ИАА нормировали на миллиграмм белка биологического препарата.
Количество 2,4-дигидроксибензойной кислоты в инкубационной смеси определяли с помощью ВЭЖХ (Knauer, Германия) УФ детектором (X 310 нм) в обращенно-фазовой системе: колонка Q8 (50 х 4 мм); подвижная фаза содержала смесь лимонной и уксусной кислот (0.03 М), титрованной уксуснокислым натрием до рН 3.6 (Shen, Sangiah, 1995). Скорость протока подвижной фазы 0.5 мл/мин.
Содержание кадмия определяли после минерализации тканей моллюска смесью азотной и хлорной кислот (3 : 1) методом атомно-абсорбционной спектроскопии в пламени гор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.