БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 7, с. 972 - 980
УДК 577.23
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПРИ УЧАСТИИ ADP/ATP-АНТИПОРТЕРА И АСПАРТАТ/ГЛУТАМАТНОГО АНТИПОРТЕРА В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ СТАРЫХ КРЫС*
© 2008 г. В.Н. Самарцев**, О.В. Кожина
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (8362)56-5781, электронная почта: samvic56@mail.ru
Поступила в редакцию 26.10.07 После доработки 28.01.08
Изучено разобщающее действие пальмитата при участии АОР/АТР-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера в митохондриях печени старых крыс (возраст 22—26 месяцев) в условиях развития перекисно-го окисления липидов и при подавлении окислительного стресса антиоксидантами. Показано, что в отсутствие антиоксидантов в условиях избыточной продукции диеновых конъюгатов протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени старых крыс не подавляется карбоксиатрактилатом или аспартатом по отдельности, в то время как, действуя совместно, карбоксиатрактилат и аспартат подавляют этот процесс на 81%. Отмечено, что в этом случае индуцированное пальмитатом разобщение лимитируется стадией, на которую не влияют карбоксиатрактилат или аспартат. Установлено, что в присутствии антиок-сидантов карбоксиатрактилат и аспартат приобретают способность по отдельности подавлять протонофор-ное разобщающее действие пальмитата. При этих условиях процесс разобщения лимитируется стадией, чувствительной к карбоксиатрактилату (АОР/АТР-антипортер) или аспартату (аспартат/глутаматный антипортер). Показано, что в отсутствие антиоксидантов АОР не подавляет разобщающее действие пальмитата как в отсутствие, так и в присутствии аспартата, в то время как в присутствии тиомочевины, тролокса или ионола АОР подавляет разобщающую активность пальмитата на 38%. Сделано заключение, что в митохондриях печени старых крыс развитие окислительного стресса в присутствии физиологических субстратов АОР/АТР-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера АОР и аспартата приводит к усилению прото-нофорной разобщающей активности пальмитата.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии печени, старение, окислительный стресс, активные формы кислорода, жирные кислоты, разобщение, АОР/АТР-антипортер, аспартат/глутаматный антипортер.
Митохондрии высших животных являются не только высокоэффективными энергетическими станциями, обеспечивающими клетку АТР и теплом, но и участвуют в ее запрограммированной гибели. Эта альтернативная функция митохондрий связана с усилением продукции активных форм кислорода (АФК) [1—3]. В настоящее время известны различные пути формирования АФК в митохондриях. В дыхательной цепи в процессе одноэлектронного восстановления кислорода в I и III комплексах образу-
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода, ДНФ — 2,4-динитрофенол, FCCP — я-трифтор метоксикарбонилцианидфенилгидразон.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press BM 07-351, 01.06.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ется непосредственно супероксидный анион-радикал, из которого вследствие дальнейших химических реакций, как ферментативных, так и неферментативных, могут образовываться пе-роксид водорода, гидроксильный радикал и другие АФК [1, 4, 5]. Показано, что при старении животных в митохондриях различных органов и тканей усиливается продукция АФК [1, 4, 6], и это состояние, называемое также окислительным стрессом, может быть связано со снижением активности одного из природных антиокси-дантов — а-токоферола [7, 8]. Развитие окислительного стресса, в свою очередь, сопровождается мутацией митохондриальной ДНК, окислительным повреждением белков и перекисным окислением липидов и согласно одной из теорий старения является главной причиной усиливающихся с возрастом дегенеративных изменений в органах и тканях [1, 4, 6].
Один из путей подавления продукции АФК в митохондриях — снижение разности электрохимических потенциалов протонов на внутренней мембране [3, 9, 10]. Это может быть достигнуто путем усиления протонной проводимости внутренней мембраны с помощью природных разобщителей окислительного фосфорилирования свободных (неэтерифицированных) жирных кислот [10]. В настоящее время известны различные пути разобщающего действия жирных кислот [9, 11]. В отсутствие ионов кальция (в присутствии ЭГТА) протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени осуществляется главным образом при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: АОР/АТР-антипортера и аспартат/глута-матного антипортера [9, 11—13]. Этот вывод сделан на основании того, что специфический ингибитор АОР/АТР-антипортера карбоксиатрак-тилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат подавляют разобщающее действие жирных кислот [9, 11—13]. Предполагается, что участие АОР/АТР-анти-портера и аспартат/глутаматного антипортера в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссо-циированной формы кислоты через бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп [9, 11]. Ранее было предположено, что модификация АОР/АТР-антипортера продуктами перекисного окисления липидов может привести к усилению протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий в присутствии жирных кислот [11]. В предварительных исследованиях нами было установлено, что в митохондриях печени старых крыс разобщающее действие пальмитата практически не подавляется карбоксиатрактилатом или аспартатом по отдельности в отличие от такового в митохондриях печени молодых крыс [14]. Интересно предположить, что избыточная продукция АФК в митохондриях старых крыс приводит к увеличению скорости переноса аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный при участии АОР/АТР-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера и устранению способности физиологических лигандов этих переносчиков подавлять этот транспорт.
Цель настоящей работы — выяснить, каким образом окислительный стресс, вызванный в митохондриях печени эндогенными процессами при старении животных, влияет на протоно-форное разобщающее действие жирных кислот при участии АОР/АТР-антипортера и аспар-тат/глутаматного антипортера. Для достижения
этой цели в митохондриях печени старых крыс в условиях усиления перекисного окисления ли-пидов было исследовано влияние лигандов этих переносчиков карбоксиатрактилата, АОР и ас-партата на индуцированное пальмитатом дыхание в отсутствие и в присутствии антиоксидан-тов: тиомочевины, тролокса и ионола, а также протонофорного разобщителя БССР.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали белых беспородных крыс-самцов, разделенных согласно принятой возрастной классификации [15] на молодых (6—9 месяцев) с массой тела 200—250 г и старых (22—26 месяцев) с массой тела 420—500 г. Условия содержания, кормления и забоя животных двух возрастных групп не различались и соответствовали необходимым требованиям, изложенным в руководстве [15]. Митохондрии из печени животных выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот БСА, как подробно описано ранее [16]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ Mops-Tris (рН 7,4). Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (70—80 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду в узкой пробирке («Eppendorf», Германия). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом; в качестве стандарта использовали БСА.
Дыхание митохондрий регистрировали при 25° с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа LP-9. Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке составляла 1,2—1,3 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ сукцинат калия, 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭГТА, 10 мМ Mops-Tris (рН 7,4). Олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенон добавляли в кислородную ячейку сразу после внесения митохондрий. При определении скорости дыхания в процессе окислительного синтеза АТР (состояние 3) среда инкубации дополнительно содержала 5 мМ KH2PO4 без олигомици-на. В этом случае через 2 мин после добавления ротенона к митохондриям добавляли 200 мкМ ADP. Коэффициент ADP/O определяли пульсовым методом [17]. Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата, ADP или аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопрягающих агентов к величине стимуляции дыхания паль-митатом по формуле 100 • AJJ(JU — Jo), где /и и Jo —
скорости дыхания соответственно в присутствии и в отсутствие пальмитата, AJu — снижение скорости дыхания ресопрягающим агентом. Удельную протонофорную активность пальмитата согласно разработанному нами ранее подходу [18] определяли как увеличение скорости дыхания митохондрий пальмитатом, отнесенное к его концентрации, по формуле (Ju — Jo)/[U], где [ U] — концентрация пальмитата, и выражали в мкМ О2/мин на 1 мкМ пальмитата.
Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях определяли после экстракции в гептане спектрофотометрическим методом [19]. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях при их инкубации в контролируемом состоянии определяли следующим образом: митохондрии (1,4 мг белка на 1 мл) суспендировали в среде инкубации при перемешивании при 25°; одновременно с митохондриями в среду вносили олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенона; другие соединения исходя из задачи исследований добавляли одновременно с этими ингибиторами. В первый раз отбор проб (по 0,7 мм) осуществляли сразу после этих добавок, во второй — через 5 мин. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях выражали как разницу между поглощением гептанового экстракта при 233 нм в начальный момент инкубации митохондрий (АА0) и через 5 мин (АА) или в относительных единицах как фактор а, который определяли по формуле а = (АА — АА0) / АА0.
В работе использовали Mops, Tris, пальмитиновую кислоту, FCCP, олигомицин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.