__СЛУХОВАЯ _
И ВЕСТИБУЛЯРНАЯ СИСТЕМЫ
УДК 612.88+57.045
ОКСИД АЗОТА КАК МОДУЛЯТОР АФФЕРЕНТНОЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ ПОЛУКРУЖНЫХ КАНАЛОВ ЛЯГУШКИ
© 2012 г. Ю. Н. Андрианов, И. В. Рыжова, Т. В. Тобиас
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6 E-mail: andryu@infran.ru
Поступила в редакцию 20.03.2012 г.
Используя метод электрофизиологической регистрации импульсной активности целого нерва и внешнюю аппликацию веществ, исследовали модулирующие свойства потенциального нейромо-дулятора оксида азота (NO) в глутаматэргической синаптической передаче изолированного вестибулярного аппарата лягушки. Регистрировали изменения ответов на аппликацию L-глутамата (L-Глу) и его агонистов NMDA и AMPA под действием донора NO SNAP и ингибитора NO-синта-зы L-NAME. Показано, что импульсные реакции, вызванные действием агонистов L-Глу NMDA и AMPA, модифицировались препаратами, ассоциированными с NO. При совместной аппликации 50 мкМ NMDA или 1мкМ AMPA и 0.1-10 мкМ SNAP возбуждающее влияние агонистов L-Глу первоначально увеличивалось, а затем уменьшалось. Аппликация 10 мкМ раствора L-NAME приводила к снижению частоты фоновой импульсной активности. При этом величина ответов на аппликацию 0.2 мМ L-Глу, 50 мкМ NMDA или 1 мкМ AMPA в растворе L-NAME статистически значимо увеличивалась относительно амплитуды ответов соответствующих агонистов в нормальном растворе. Представленные данные позволяют предполагать взаимодействие NO- и глутаматэргической систем волосковых рецепторов и, что реальный механизм модуляции возбуждающей синаптической передачи с помощью NO, связан со сложной комбинацией пре- и постсинаптических механизмов в глутаматэргических синапсах вестибулярных органов.
Ключевые слова: оксид азота, возбуждающие аминокислоты, нейромодуляторы, афферентный синапс, вестибулярный аппарат
Оксид азота (NO) является нейроактивным веществом, привлекшим большое внимание исследователей с момента своего открытия (Böhme et al., 1991; Garthwaite, 1991, 2008; Snyder, 1992; Szabo, 1996). Он представляет собой уникальный газообразный вторичный мессенджер, широко распространенный в организме и обладающий многообразным спектром действия. Субстратом для выработки NO в клетках является аминокислота L-аргинин. Под действием катализирующего фермента NO-синтазы (NOS) и ряда сопутствующих ко-факторов в организме происходит реакция присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина и образование NO и L-цитрули-на. В настоящее время различают три изоформы NOS (NOS I, II, III) в соответствии с особенностями их локализации, механизмов действия и
биологического значения (Marletta, 1993; Schmidt et al., 1993; Moneada et al., 1991; Lincoln et al., 1997; Garthwaite, 1991, 2008). Изоформы NOS I и III являются нейрональными конститутивными кальций-кальмодулин-зависимыми ферментами. Изоформа NOS II - это кальций-независимая ин-дуцибельная или макрофагальная форма может быть экспрессирована практически в клетках любого типа только под действием бактериальных липополисахаридов, некоторых эндотоксинов и цитокинов, например, интерлейкинов-1 и -2, у-интерферона и других агентов.
Многочисленные данные нейроанатомических, нейрохимических и физиологических исследований привлекли внимание к NO как возможному нейротрансмиттеру/нейромодулятору в вестибулярной и слуховой системах различных жи-
вотных. Нейрохимическими методами было показано присутствие NOS в волосковых клетках, афферентных и эфферентных нервных окончаниях внутреннего уха многих видов животных от амфибий до млекопитающих (Fessenden et al., 1994; Flores et al., 2001; Hess et al., 1998a, b; Lysakowski, Singer 2000). В последнее время с использованием NO-селективных электродов были получены прямые данные, указывающие на то, что сенсорный эпителий саккулюса лягушки выделяет NO в биологически значимых количествах (> 50 нМ) для выполнения своей специфической функции (Lv et al., 2010). Данный процесс значительно увеличивался под действием эфферентного нейромодулятора ацетилхолина и зависел от присутствия Са2+ в растворе. Аппликация ингибитора NOS L-NAME уменьшала количество выделенного NO, что было связано, вероятно, с ин-гибированием NOS. Электрофизиологическими последствиями выделения NO было уменьшение мембранных осцилляций и возбудимости волосковых клеток.
Исследования, выполненные на нейронах гиппокампа с использованием NO селективных микроэлектродов и электрохимической техники, выявили непосредственное участие глутаматэр-гической системы в генерации NO (Lourenço et al., 2011). При этом было показано, что выработка NO in vivo возрастала при активации ионотроп-ных глутаматных рецепторов эндогенным нейро-трансмиттером L-Глу и агонистом соответствующих рецепторов NMDA. Аппликация блокатора NMDA рецепторов МК-801 и блокатора AMPA рецепторов NBQX значительно уменьшала выработку NO, вызванную L-Глу. Полученные результаты, несомненно, доказали участие интегрированной активации NMDA и AMPA глутаматных рецепторов в синтезе NO.
Имеющиеся данные о локализации NOS в периферических структурах слуховой и вестибулярной систем различных моделей позволили предполагать, что NO может оказывать специфическое биологическое действие на синаптическую передачу и участвовать в формировании афферентного разряда в волосковых рецепторах. Такая возможность обусловлена тем, что выделяемые локально небольшие количества NO могут диффундировать от места синтеза на расстояние до100 мкм и быстро инактивироваться оксидной реакцией. В отличие от классических нейротрансмиттеров NO не имеет специфического «NO рецептора» на постсинаптической мембране. При этом механизм действия NO основан на его способности легко проникать в клетки-мишени не нуждаясь в
мембранных рецепторах. Внутри клетки NO осуществляет модуляцию активности серии ферментов, которой одна из важнейших является внутриклеточная растворимая гуанилат циклаза (sGC). При активации этого фермента происходит образование циклического гуанилат монофосфата (cGMP), контролирующего многие физиологические функцие организма. Такие особенности действия NO позволяют отнести его к категории ретроградных мессенджеров.
Учитывая факт присутствия NOS в базальных областях внутренних и наружных клеток органа слуха и вестибулярного аппарата, вестибулярных ганглиозных клетках и нервных окончаниях, возникает вопрос о функциональной значимости NO в деятельности волосковых клеток. Как хорошо известно, регуляция активности волосковых клеток осуществляется с помощью афферентной и эфферентной систем иннервации. При этом решающая роль в механизме синаптической передачи принадлежит возбуждающим аминокислотам, вероятнее всего L-Глу, который выполняет роль эндогенного нейромедиатора (Guth et al., 1998a; Ottersen et al., 1998). Известно, что эффекты L-Глу в синаптических структурах реализуются посредством активации ионотропных глутамат-ных рецепторов, включающих N-метил-Б-ас-партатный (NMDA) тип, каинатный (KA) тип и а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-про-пионовый (AMPA) тип рецепторов, а также ме-таботропных глутаматных рецепторов (Zucca et al., 1993; Prigioni et al., 1994; Guth et al., 1998a, b; Andrianov et al., 2005).
Цель работы - исследование взаимодействия NO- и глутаматэргической систем в афферентной синаптической передаче периферического отдела вестибулярной системы лягушки.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Эксперименты выполняли на лягушках Rana temporaria массой около 20 г. В работе использовано 72 животных. Хрящевую капсулу с лабиринтом иссекали из тела животного и переносили в экспериментальную камеру объемом около 1 мл, где под контролем бинокулярного микроскопа подвергали окончательной препаровке. Осуществляли непрерывную перфузию препарата нормальным раствором комнатной температуры. Использовали нормальный раствор следующего состава (в мМ): NaCl - 117; KCl - 2.5; NaHCO3 - 1.2; NaH2PO3 • 2H2O - 0.17; Na2HPO4 -2.5; CaCl2 - 1.8; глюкоза - 2.5. Вещества раство-
Рис. 1. Схематическое изображение экспериментальной установки для электрофизиологической регистрации множественной импульсной активности нерва, иннервирующего ampulla posterior, в изолированном препарате внутреннего уха лягушки. Ампуллярный нерв заднего канала засасывался стеклянной пипеткой, заполненной раствором Рингера и соединенной с усилителем переменного тока, осциллоскопом и лабораторным компьютером. Utr -утрикулюс; Sac - саккулюс; Lag - лагена; A.a., A.l., A.p. - передняя, латеральная и задняя ампулы соответственно.
ряли в необходимых концентрациях при рН 7.4. Аппликацию исследуемых растворов проводили методом внешней перфузии. При этом полная замена раствора в экспериментальной камере происходила примерно за 60 с. Каждый эксперимент начинали не ранее, чем через 30 мин после окончания препарирования и полной стабилизации уровня импульсной активности. Для анализа использовали только препараты со стабильным уровнем фоновой активности. В опытах применяли следующие вещества: L-Глутамат (L-Глу), донор NO S-нитрозо-N-ацетил-DL-пеницилла-мин (S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine) (SNAP) и ингибитор NOS ^нитро^-аргинин метиловый эфир гидрохлорид (N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) (L-NAME) (все Sigma). Учитывая тот факт, что SNAP очень нестабилен в растворе, обладает повышенной фото- и термочувствительностью, рабочие растворы SNAP и L-NAME готовили непосредственно перед экспериментом в условиях минимальной освещенности и до аппликации держали при пониженной температуре.
Регистрировали множественную импульсную активность афферентных нервных волокон, кон-
тактирующих с рецепторным эпителием заднего полукружного канала (ampulla posterior), при помощи засасывающего стеклянного электрода с диаметром кончика 100-300 мкм (рис. 1). Величину диаметра кончика электрода подбирали соответствующей диаметру вестибулярного нерва данного препарата. Использовали усилитель биопотенциалов, изготовленный в лабораторных условиях. Импульсную активность контролировали на экране катодного осциллоскопа, параллельно преобразовывали в прямоугольные импульсы длительностью 2 мс и в т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.