ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 4, с. 398-404
= БИОХИМИЯ =
УДК 575:579.842.11.577.1
ОКСИД АЗОТА УЧАСТВУЕТ В РЕГУЛЯЦИИ СБОРКИ Fe-S-КЛАСТЕРОВ БЕЛКОВ И ФОРМИРОВАНИИ БИОПЛЕНОК КЛЕТКАМИ Escherichia coli
© 2013 г. С. В. Васильева*, Д. А. Стрельцова*, И. А. Старостина*, Н. А. Санина**
*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 ** Институт проблем химической физики РАН, 142432 Московская обл., Черноголовка, Институтский просп., 18 E-mail: svasilieva@polymer.chph.ras.ru Поступила в редакцию 21.11.2012 г.
Изучены функции оксида азота (NO) в регуляции обратимых процессов сборки Fe-S-кластеров белков и формирования биопленок в Escherichia coli. Впервые использованы доноры NO — S-нитро-зоглутатион (GSNO) и кристаллические нитрозильные комплексы железа с серосодержащими алифатическими лигандами цисаконитом (ЦисА) и пенаконитом. Исследованы клетки штамма дикого типа E. coli MC4100, его мутанты AiscA и AsufA и двойной мутант-паралог AiscA/sufA с делециями в альтернативных путях доставки Fe2+ для сборки Fe-S-кластеров. Изучены планктонный рост культур, масса зрелых биопленок и экспрессия SoxRS[2Fe-2S]-регулона и выявлена их зависимость от генотипа штаммов, процесса сборки Fe-S-кластеров железосерных белков, структуры NO-доноров, наличия в среде инкубации Fe2+-хелатора ферена. Антибиотик ципрофлоксацин (CF) использован в позитивном контроле как ингибитор пленкообразования клетками E. coli. Установлено, что доноры NO — регуляторы сборки Fe-S-кластеров в E. coli — контролируют планктонный рост культур и процесс формирования зрелых биопленок; токсические дозы NO резко (в 3—4 раза) стимулируют уход клеток в биопленки как ответ на развитие нитрозативного стресса; доноры NO в физиологических концентрациях ЦисА и GSNO снижают формирование зрелых биопленок и по активности сопоставимы с CF. Регуляция оксидом азота процессов реконструкции Fe-S-кластеров в железосерных белках и формирования биопленок свидетельствует о взаимосвязи этих функций в E. coli.
DOI: 10.7868/S0002332913040164
Актуальность проблем, связанных с резистентностью пленкообразующих бактериальных патогенов к различным стрессам, включая антибиотики, очевидна (Ito et al., 2009; Wu, Outten, 2009). Однако исследования фундаментальных механизмов формирования биопленок in vivo и работы по использованию оксида азота (NO) пока немногочисленны. Эти фундаментальные работы, выполненные в основном на Escherichia coli, касаются реализации сигнальных функций NO в регуляции процессов жизнеобеспечения в норме и в условиях стресса с учетом избирательного накопления NO в клетках при анаэробном росте. Механизм NO-регулируемого редокс-контроля генной экспрессии, впервые описанный на примере железосерных белков аконитазы и фумарат-нитратредуктазы E. coli (Beinert, Kiley, 1996), связан с распадом/реконструкцией Fe-S-кластеров, а не с изменениями их окислительного статуса. В работе Динга и Демпла (Ding, Demple, 1996) этот механизм изучен на модели белка SoxR[2Fe-2S] — регуляторе глобального механизма защиты E. coli от окислительного стресса при избытке супероксида и NO.
Процесс распада кластеров обратимый. На модели Azotobacter vinelandii установлено, что сборка Fe-S-кластеров осуществляется в ходе многоэтапной реконструкции консервативного кластера генов iscRSUA—hscBA—fdx (Zheng, 1998). Этот кластер генов отвечает за биогенез железосерных центров и в E. coli, однако в условиях стресса здесь активируется также второй путь регуляции sufABCDSE (Takahashi, Nakamura, 1999). Главные продукты этих генов — железосерные белки IscA, SufA и IscS — аккумулируют железо и серу и транспортируют их на структуру сборки ("scaffold" — платформа IscU). Репрессором всей системы сборки кластеров в E. coli является железосер-ный белок IscR[2Fe-2S]2+. Была установлена также важнейшая альтернативная функция этого белка в механизме формирования биопленок — активации белка типа I FimE-рекомбиназы для клеточных структур фимбрий, обеспечивающих cвязь биопленок с субстратом (Schwartz et al, 2001; Wu, Outten, 2009). Так белок IscR участвует в регуляции резистентности бактерий к антибиотикам.
Базируясь на этих данных, мы начали изучение взаимосвязи механизмов регуляции NO-до-норами сборки Fe-S-кластеров и формирования
биопленок клетками E. coli как фундаментальной основы для поиска перспективных низкотоксичных регуляторов образования биопленок в целях замены антибиотиков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован родительский штамм E. coli MC4100 F-[araD139]B/r A(argF-lac)169 &lambda-e14-flhD5301 A(fruK-yeiR)125 (fruA25) relA1 rpsL150(strR) rbsR22 AfimB-fmE)632(::IS1) deoC1, wt (дикого типа) и его изогенные мутанты: E. coli MC4100 iscA/sufA, E. coli MC4100 AiscA, E. coli MC4100 AsufA. В штаммах E. coli MC4100 wt и E. coli MC4100 AiscA/sufA содержится конструкция [soxS::lacZ] в составе плазмиды pTN1530. Штаммы были любезно предоставлены нам Дин-гом (Tan et al., 2009).
Динамика роста культур была изучена на полноценной (LB — Луриа—Бертани) и минимальной (М9) питательных средах с внесением ампициллина (100 мкг/мл) либо без него. Чашки инкубировали при 31°С в течение 24 ч в аэробных либо анаэробных условиях. В последнем случае была использована система GasPak с палладиевым катализатором (Becton Dickinson, США).
Экспрессию гена soxS регистрировали опосредованно, по активности фермента ß-галактозида-зы в колориметрическом тесте. Эксперименты были проведены в соответствии с протоколом Миллера (1916) с использованием O-нитрофе-нил^^-галактопиранозида (ONPG) в качестве хромогена для ß-галактозидазы. Активность фермента измеряли на цифровом спектрофотометре PD-303UV (Apel Co. Ltd, Япония) при длине волны X = 420 нм. Число единиц фермента (E) рассчитывали по уравнению Е = 1000 ОD420/t, где ОD — оптическая плотность при 420 нм, t — время инкубации с хромогеном.
Рост планктонных культур при 25°С в LB-сре-де (OD600) и массу зрелых биопленок (OD510) после их окрашивания кристаллвиолетом оценивали спектрофотометрически с использованием одноразовых кювет из оптического полипропилена (Kartell, Италия). При этом и была отмечена очень незначительная адсорбция красителя на стенках кювет — фон кюветы.
Водный раствор S-нитрозоглутатиона (GSNO) был получен методом Ванина (Васильева и др., 2001). Кристаллические нитрозильные комплексы железа с серосодержащими алифатическими лигандами (NO-доноры) с цистеамином (цисако-нит (ЦисА) - [Fe2(S(CH2)2NH3)2(NO)4]SO4 • 2.5H2O) и пеницилламином (пенаконит (ПенА) — [Fe2(S(C(CH3)2CH(NH3)COOH))2(NO)4]SO4 • 5H2O) — были синтезированы в ИПХФ РАН (Алдошин и др., 2001).
Хромоген для ß-галактозидазы — ONPG (Sigma, США); фторхинолоновый антибиотик — ци-профлоксацин (CF) (Promed Exports, Индия) в концентрации 0.07 мкг/мл; Fe2+-хелатор ферен — динатриевая соль 5,5'-[3-(2-пиридил)-1,2,4-триа-зин-5,6-диил]дифуран-2-сульфоновой кислоты (Ferene, Sigma, США) в сублетальной концентрации 0.2 мМ.
На рисунках представлены усредненные значения параметров, полученных в четырех экспериментах.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клетки E. coli MC4100 wt и его одиночные мутанты с делециями iscA или sufA в составе набора генов сборки Fe-S-кластеров стабильно росли на агаризованных средах LB и М9 независимо от условий аэрации. Однако рост двойного мутанта-паралога E. coli MC4100 SiscA/sufA был снижен на среде LB и полностью ингибирован на среде М9 при аэробной инкубации (рис. 1).
На рис. 2 представлены результаты изучения действия NO-доноров ПенА и ЦисА как регуляторов формирования биопленок по сравнению с действием антибиотика CF. Изученные соединения ингибировали планктонный рост культуры E. coli MC4100 wt (рис. 2а). Растворы доноров NO 0.1 мМ ПенА и 0.01 мМ ЦисА были эквитоксич-ными (рис. 2а, 2 и 4), но при этом ПенА не изменял массу зрелых биопленок по сравнению с контролем (рис. 2б, 2), а ЦисА в 2 раза снижал ее (рис. 2б, 4). Обработка клеток ПенА в концентрации 1 мМ (рис. 2, 3) приводила к цитотоксическо-му эффекту и инициировала переход клеток в биопленки с 1.5-кратным превышением контрольного уровня. Лидером ингибирования зрелых биопленок был CF (рис. 2б, 5), но при равном токсическом действии CF и 1 мМ ПенА именно донор NO инициировал самый высокий показатель "ухода" клеток в биопленки у штамма E. coli MC4100 wt.
На рис. 3 приведены результаты изучения зависимости планктонного роста и показателей зрелых биопленок от генотипа клеток и Fe^-хе-латора ферена. Ферен в сублетальной концентрации двукратно подавлял формирование зрелых биопленок в обоих штаммах E. coli MC4100 wt и паралоге SiscA/sufA, а также двукратно снижал "продуктивность" клеток в их формировании (отношение OD570 : OD600). При сравнении зависимости "продуктивности" от генотипа в вариантах без ферена видно, что в штамме-паралоге она составляет 0.33 : 0.24 = 1.38 и превышает показатель дикого типа в 1.5 раза (0.44 : 0.47 = 0.94). Это — свидетельство преобладания тенденции "ухода" в биопленки клеток мутантного штамма в ответ на развитие Fe2+-зависимого окислительно-
Рис. 1. Рост штаммов E. coli MC4100 wt и его мутантов на среде М9 с агаром при аэробной (а) и анаэробной (б) культивации.
Рис. 2. Планктонный рост клеток ODg00 (а) и масса зрелых биопленок OD570 (б) в E. coli MC4100 wt при 24-часовой обработке клеток ПенА, ЦисА и CF. 1 — контроль, без обработки; 2 — ПенА, 0.1 мМ; 3 — ПенА, 1 мМ; 4 — ЦисА, 0.01 мМ; 5- CF, 0.07 мг/л; 6 - фон кюветы.
го стресса: с одной стороны, в этих клетках заблокированы генетические пути доставки свободного железа для построения Fe-S-кластеров, а с другой — это свободное железо как источник окислительного стресса не связывается ференом в нерастворимый комплекс.
С учетом определяющей роли железа в биологической активности N0 мы использовали МО-донор ОВМО, не содержавший железа в структуре, для изучения механизма формирования биопленок. На рис. 4 представлены результаты изучения планктонного роста и зрелых биопленок в диком
(а)
(б)
0.4
Q
О
0.2
■ 1
□ 5
Ш 4
5
MC4100 MC4100 wt kiscA/sufA
MC4100 MC4100 wt kiscA/sufA
Рис. 3. Планктонный рост клеток ODg00 (а) и масса з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.