МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 175-179
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.4.044: 546.11.02.2
ОКСИД ДЕЙТЕРИЯ КАК СТРЕССОВЫЙ ФАКТОР У МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ МЕТНУЬОРН1Ь№ 8Р.
© 2004 г. А. Н. С. Нево*, А. Б. Пшеничникова*' Д. А. Складнев**' В. И. Швец*
*Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва **Государственный научный центр генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
Поступила в редкцию 07.07.2003 г.
Изучены закономерности адаптации метилотрофных бактерий МеШу\орЫ\и& эр. В-7741 к росту в высокодейтерированной среде. Впервые обнаружена перекрестная адаптация к дейтерированной среде клеток, предварительно адаптированных к другим стрессам - осмотическому и окислительному. Активность каталазы была значительно выше в дейтерированных клетках, чем в контрольных. Дейтерированные бесклеточные культуральные жидкости оказывали протекторное действие на рост МеШуХорЫЫъ эр. В-7741 в дейтерированных средах и способствовали повышению выхода дейтерированной биомассы. На основании экспериментальных результатов и данных литературы сделано предположение о сходстве механизмов адаптации бактерий к оксиду дейтерия и окислительному и осмотическому стрессам.
Ключевые слова: адаптация, оксид дейтерия, окислительный и осмотический стресс, внеклеточные факторы адаптации.
Многие микроорганизмы способны к росту в высокодейтерированных средах (95-99.8% оксида дейтерия 2H2O), однако в большинстве случаев рост в дейтерированных средах замедлен и требует предварительной адаптации. Среди микроорганизмов, способных расти в этих искусственных условиях, продолжительность адаптации и ростовые характеристики адаптированных штаммов в высокодейтерированных средах зависят от природы источника углерода и особенностей метаболизма. Механизмы, отвечающие за адаптацию к 2H2O, не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались [1]. Особое значение имеет выяснение причин возникновения изотопных эффектов дейтерия для получения дейтерированных биологически активных веществ [2], необходимых в биохимических и биомедицинских исследованиях [3].
Действие 2H2O на клетки многообразно, однако все эффекты можно разделить на две основные группы: изотопный эффект дейтерия - субстрата (ИЭС), и изотопный эффект 2H2O в среде как растворителя (ИЭР).
ИЭС вызван различным энергетическим потенциалом С—1H- и С-2Н-связей в молекуле субстрата и продуктах его метаболических превращений. Известно, что по сравнению с оксидом дейтерия, дейтерированный источник углерода не так существенно влияет на рост клеток, и мик-
1 Адресаты для корреспонденции (e-mail: biotechnolo-
gy@mtu-net.ru; e-mail: skladda@genetika.ru).
роорганизмы могут использовать полностью дейтерированный аналог своего субстрата. ИЭР в биологических системах изучен недостаточно, однако можно предположить, что именно с этим эффектом связано также малоизученное явление адаптации к 2Н20-средам.
Физико-химические свойства 2Н20 и ХН20 различны, поэтому присутствие 2Н20 в культураль-ной среде влияет на физиологию клетки, в частности на свойства мембран: их проницаемость [4], мембранный транспорт [5], активность мембранных ферментов [6]. Известно, что 2Н20 обладает более низким химическим потенциалом, чем ХИ20, поэтому раствор солей в 2Н20 оказывается гиперосмотическим по сравнению с соответствующим раствором в ХИ20. Следовательно, 2Н20 индуцирует выход ХИ20 из клеток, помещённых в 2Н20-среду [7]. Осмотический шок, вызванный действием 2Н20, приводит к потере внутриклеточного калия в клетках водорослей [5]. Отмечено, что характерным ответом бактерий Escherichia coli на действие перекиси водорода Н202 (окислительный стресс), является повышение активности каталазы (КФ 1.11.1.6), а также потеря клетками калия [8].
Физиологическое значение внезапной потери К+ клеткой во время различных стрессовых ситуаций до сих пор не вполне понятно. В литературе рассматриваются некоторые возможные причины такой реакции клеток: повреждение клеточной оболочки [9], возбуждение мембраны [5] и открытие К+ каналов с участием глутатиона [8].
Есть данные о том, что выход К+ через каналы контролирует окислительно-восстановительный потенциал клетки [10]. Снижение уровня внутриклеточного калия во время окислительного стресса у E. coli может быть одним из факторов, вызывающих релаксацию ДНК, и, следовательно, индукцию систем репарации ДНК [9]. Аналогичное действие оказывает и 2Н20 - активность репарационной системы Hex у Streptococcus pneumoniae, адаптированных к 2Н20, выше, чем у клеток дикого типа [11]. Следовательно, присутствие 2Н20 в культуральной среде приводит к индукции адаптивного ответа, который можно сравнить с ответами, вызываемыми другими стрессовыми условиями. В таком случае, возникает вопрос, сохраняются ли в процессе адаптации к 2Н20 явления, характерные для адаптации к другим стрессовым факторам, например перекрестная адаптация и образование внеклеточных факторов адаптации [12, 13].
Целью данной работы было: 1) исследовать влияние условий получения инокулята на параметры роста метилотрофных бактерий Methylophi-lus sp. B-7741 в дейтерированной среде; 2) определить влияние дейтерированной среды на активность каталазы; 3) изучить биологическое действие дейтерированной бесклеточной культуральной жидкости (КЖ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явилась облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741, которая имеет неподвижные клетки палочковидной формы размером 0.3-0.4 х 0.6-0.7 мкм и образует ровные круглые колонии диаметром 0.5-3 мм бело-кремовой окраски. Оптимальные условия для роста: 28-30°С, pH 6.8-7.2. Methylophilus sp. В-7741 была выделена нами из смешанной метанолутилизирующей культуры, содержащей также грамположительные бактерии (неизвестной пока таксономической принадлежности).
Культивирование проводили на синтетической среде, содержащей в 1 л: NaN03 - 1 г; MgS04 ■
■ 7H20 - 0.2 г; CaCl2 - 0.02 г; K2HP04 - 1.5 г; KH2P04 - 0.7 г; раствор микроэлементов - 20 мл. Состав раствора микроэлементов на 100 мл: FeS04 ■ 7H20 - 100 мг; ZnS04 ■ 7H20 - 5 мг; MnCl2 ■
■ 4H20 - 1.5 мг; CoCl2 ■ 6H20 - 10 мг; CuCl2 ■ 5H20 -5 мг; NiCl2 ■ 6H20 - 1 мг; Na2Mo04 - 1.5 мг; ЭДТА -250 мг.
Среду стерилизовали при 0.8 атм 30 мин (раствор фосфатов стерилизовали отдельно), затем добавляли 5 или 10 мл метанола на 1 л среды (0.5 или 1.0 об. % соответственно).
Дейтерированная среда имела тот же компонентный состав, но была приготовлена на основе
оксида дейтерия (99.85 ат.% 2Н) и содержала дей-терометанол С2Н302Н 99, 7 ат.% 2Н.
Адаптацию культуры к высокодейтерирован-ным средам проводили ступенчатым увеличением концентрации 2Н20 в ростовых средах: 0-7595-99.8% 2Н20. Для предотвращения разбавления дейтериевой метки протием атмосферной влаги, все эксперименты по выращиванию бактерий на среде, содержащей максимальную концентрацию 2Н20, проводили только в колбах, закрытых специальными пробками-ловушками с сухим силика-гелем.
Для приготовления посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу, культуру ИеЛу1орЫ1ш ер. В-7741 выращивали в стандартной минимальной среде в присутствии соответственно 86 мМ (0.5%) КаС1 или 33 мкМ (0.0001%) Н202 до стационарной фазы роста (~48 ч).
Приготовление клеточного экстракта из 1Н- и 2Н-биомассы для определения активности каталазы проводили следующим образом. 1Н- и 2Н-клетки, выращенные на стандартной и дейтерированной средах соответственно, отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, ресуспенди-ровали в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.0 и разрушали ультразвуком (3 раза по 1 мин при 0°С). Полученный гомогенат центрифугировали при 8000 g 30 мин. Осадок отбрасывали, а суперна-тант использовали в качестве клеточного экстракта.
Содержание белка в экстрактах определяли по методу Лоури, для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (БСА).
Активность каталазы в экстракте измеряли методом, описанном в работе [14] при 235 нм. Активность выражали в нмоль Н202, которая разлагается за 1 мин, на 1 мг белка.
Для изучения биологического действия дейтерированной КЖ неадаптированную культуру ЫеАу1о-рНйш ер. В-7741 выращивали в среде, содержащей 95% 2Н20 и 0.2% С2Н302Н 24 ч до 0П600 0.1 ед. опт. плотности (экспоненциальная фаза) или 72 ч до 0П600 0.3 ед. опт. плотности (стационарная фаза), после чего КЖ отделяли от биомассы центрифугированием и стерилизовали, используя мембранные фильтры. Для подтверждения стерильности КЖ, ее смешивали с одним объемом свежей среды, добавляли метанол до концентрации 1 об. % и инкубировали при 30°С - рост отсутствовал. На основе стерильной КЖ готовили среды, состоящие из 75 об. % свежей дейтерированной (95% 2Н20) среды и 25 об. % бесклеточной дейтерированной КЖ, добавляли метанол до концентрации 1 об. % и инокулировалии неадаптированной культурой.
Все опыты повторяли 3-4 раза. В работе представлены результаты типичных экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Культуры Methylophilus sp. B-7741 адаптировали к 2Н-среде, посредством проведения ряда пассажей на среды с увеличивающимся содержанием оксида дейтерия в среде. Влияние такой ступенчатой адаптации на продолжительность лаг-фазы и удельную скорость роста представлено в табл. 1. Если у неадаптированной культуры рост в 2Н-среде практически отсутствовал, то после ступенчатой адаптации клеток к 2Н20 увеличивалась удельная скорость роста культур при одновременном сокращении лаг-фазы. Эти данные согласуются с полученными нами ранее результатами для факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum [2].
В других экспериментах было изучено влияние на скорость роста Methylophilus sp. B-7741 в 2Н-среде качества инокулята, которое зависело от способа его подготовки, а именно - получения его в стрессовых условиях. Для этого инокулят выращивали в условиях осмотического шока (86 мМ NaCl в стандартной среде) или в условиях окислительного стресса (33 мкМ H202 в стандартной среде). А когда аликвоту выращенных таким образом культур переносили в 2Н-среду, бакте
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.