УДК 581.1:577.352:547.3
ОЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА - МОДУЛЯТОР ИОННЫХ КАНАЛОВ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК ХАРОВОЙ ВОДОРОСЛИ Chara corallina
© 2012 г. А. А. Катаев1*, О. М. Жерелова2, В. М. Грищенко3
Институт биофизики клетки РАН,142290, Пущино, Московская обл.; *электронная почта: aakka@rambler.ru 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
3Институт биологического приборостроения РАН, 142290, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 31.08.2011 г.
Присутствие 5—30 мкМ олеиновой кислоты (С^.^^) в омывающем клетку харовой водоросли Chara corallina растворе вызывало значительное уменьшение амплитуды кальциевого и Са2+-активиро-ванного хлорного токов в плазматической мембране. Введение олеиновой кислоты (10 мкМ) с ци-топлазматической стороны мембраны перфузированных клеток подавляло развитие Са2+-тока. Это блокирование Са2+-тока имело обратимый характер, и после удаления олеиновой кислоты Са2+-проводимость клеток восстанавливалась. При этом не обнаружено изменения неспецифического тока утечки, характеризующего целостность липидной компоненты мембраны. Увеличение с внешней стороны клетки концентрации олеиновой кислоты до 50—100 мкМ практически полностью и необратимо подавляло входящие ионные токи и приводило к значительному росту неспецифического тока утечки и электропроводности плазматической мембраны, т.е. нарушению ее целостности. Полученные результаты обсуждаются в связи с возможными механизмами цитотоксичности и транспорта олеиновой кислоты и ее комплексов с а-лактальбумином (HAMLET и Ьа-OA) через плазматическую мембрану различных клеток.
Ключевые слова: харовые водоросли, плазмалемма, ионные каналы, олеиновая кислота.
Свободные (неэтерифицированные) ненасыщенные жирные кислоты (НЖК) обладают всеми свойствами эндогенных биорегуляторов с широким спектром действия. Они участвуют во многих клеточных процессах: регулируют активность различных ферментов, ионных каналов, модулируют фосфоинозитидный и сфингомиелиновый циклы. НЖК участвуют в передаче клеточного сигнала в качестве вторичных мессенджеров, выступают в роли эффекторов связывания стероидных гормонов с рецепторами, оказывают влияние на транскрипцию некоторых генов [1].
НЖК (в том числе и олеиновая кислота, С18:1:9с^) являются активными модуляторами концентрации свободных ионов в клетке [2—4]. Так, на миоцитах желудочка сердца морских свинок показано, что олеиновая кислота в концентрации 3—30 мкМ индуцирует увеличение потенциал-зависимого Са2+-тока [2]. Перфузия миоцитов 10 мкМ олеиновой кислотой приводит к значительному увеличению концентрации Са2+. Соответствующие вольт-амперные характеристики показывают увеличение амплитуды кальциевого тока без сдвига порога активации и без смещения пикового значения максимума тока [2]. С другой стороны, в клетках гладкой мускулатуры кишечника кролика олеиновая кислота и другие
^ис-НЖК ингибировали потенциал-зависимый Са2+-ток [3]. В обоих случаях высказано предположение о прямом воздействии жирных кислот либо на липидные участки мембраны около каналов, либо на белки самих каналов [2]. На эпителиальных клетках трахеи зародышей человека показано, что многие ^ис-НЖК ( в том числе и олеиновая кислота) блокируют С1--каналы дозозависимым способом. Среднее время открытия канала уменьшалось в 10 раз в присутствии 25 мкМ некоторых ^ис-НЖК [4].
Несомненный интерес представляют экспериментальные данные о химиотерапевтических и фармакологических свойствах олеиновой кислоты. Известно, что а-лактальбумины женского и коровьего молока образуют молекулярный комплекс с олеиновой кислотой, названный HAMLET или BAMLET (human or bovine alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells), обладающий цитотоксической и противоопухолевой активностью [5]. Позднее другим, более простым методом мы получили аналогичный цитотоксичный комплекс, названный La-OA (а-Lactalbumin — Oleic Acid) [6]. Однако до сих пор нет единого мнения о природе ци-тотоксичности и противоопухолевой активности этих комплексов и о роли их отдельных компонентов в формировании этих свойств [7, 8].
В опытах in vitro наблюдали собственную цито-токсичность экзогенной олеиновой кислоты в культурах зародышевых, незрелых и некоторых опухолевых клеток [9, 10]. Цитотоксичность олеиновой кислоты проявлялась в пораженных клетках увеличением синтеза NO, накоплением триглице-ридов, генерацией реактивных форм кислорода, фосфорилированием и дефосфорилированием ки-наз и фосфатаз [10]. Имеются также экспериментальные данные о гипотензивном действии олеиновой кислоты. Установлено, что именно высокое содержание олеиновой кислоты в оливковом масле (до 80%) отвечает за его нормотензивный эффект [11].
Несмотря на обилие информации о многообразии биоэффекторных функций олеиновой кислоты, до сих пор не исследованы некоторые ключевые моменты ее взаимодействия с клеткой, а именно механизм транспорта внутрь клетки и участие в этом процессе ионных каналов. По-прежнему не установлено, является ли олеиновая кислота цитотоксическим фактором, определяющим противоопухолевые свойства комплексов HAMLET и La-OA.
Клетки харовых водорослей хорошо изучены электрофизиологически [12]. Наличие в плазма-лемме харовых водорослей К+-, Са2+- и С1--кана-лов, по основным своим свойствам практически идентичных ионным каналам многих животных клеток [13-16], дает возможность исследовать на этой простой (по сравнению с животными клетками) модели механизмы взаимодействия различных биологически активных соединений с ионными каналами и их транспорта через плазматические мембраны. Известно, что гены большинства семейств ионных каналов растений имеют значительную гомологию с аналогичными генами животных [17].
Ранее нами было показано [18], что обработка как нативных, так и перфузированных клеток Chara corallina 10-30 мкМ олеиновой кислотой приводила к дозозависимой инактивации кальциевого и хлорного токов.При отмывке олеиновой кислоты исходным наружным раствором амплитуда кальциевого тока восстанавливалась, а неспецифический ток утечки при этом не изменялся.
Предлагаемая работа посвящена более детальному изучению влияния различных концентраций экзогенной олеиновой кислоты ( от 5 до 100 мкМ ) на ионные токи и структурные характеристики плазмалеммы клеток C. corallina.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки харовой водоросли С. евгаШпа выращивали в аквариуме при температуре 18—20°С в
искусственной прудовой воде (ИПВ), содержащей (в мМ): 0.1 КС1, 1.0 NaCl, 0.1 CaCl2.
Эксперименты проводили на интернодальных интактных и перфузированных изнутри клетках C. corallina, техника перфузии детально изложена в работе [19]. Измерение и регистрацию переходного тока при изменении потенциала на мембране проводили в режиме фиксации напряжения на рабочем участке клетки длиной 2 мм по классической четырехэлектродной методике [20]. Для фиксации напряжения на мембране использовали специализированный операционный усилитель Dagan 8500 (США), в качестве управляющего и регистрирующего устройства — компьютер с платой ЦАП/АЦП Data Translation DT2801A и Lcard 1250. Для мониторинга эксперимента использовали специализированные пакеты программ BioQuest и pClamp 6.
В работе использовали растворы для внутренней и наружной перфузии следующего состава: наружный раствор (в мМ): 1.0 NaCl, 1.0 СаС12, 5.0 HEPES-трис, 150 сахароза, рН 7.3; внутриклеточный раствор содержал (мМ): 8.8 EGTA, 10 CsC1, 4.0 СаС12, 10 HEPES-трис, 240 сахароза, рН 7.3. Олеиновую кислоту (Sigma-Aldrich ) растворяли в 96% этаноле, предварительно очищенном от органических примесей с помощью двукратной перегонки над К2МпО4 и активированным углем. Использовали определенные аликвоты маточного раствора олеиновой кислоты (10 мМ), которые суспендировали в фиксированном объеме внеклеточного или внутриклеточного раствора, учитывая соответствующие разведения при определении номинальной используемой концентрации олеиновой кислоты. Растворы трис, HEPES, EGTA и сахарозы (Sigma-Aldrich), NaCl, KCl, KOH (Fluka) готовили на деионизованной воде.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Представленные результаты получены на интернодальных нативных и перфузированных клетках С. евгаШпа в условиях фиксации потенциала на мембране [21]. Известно, что генерация потенциала действия клетки обеспечивается совокупностью входящих Са2+- и Са2+-активируемых С1--токов, а также выходящего К+-тока [19, 20].
Для регистрации Са2+-компоненты тока использовали способность Са2+- и С1--каналов находиться разное время в инактивированном состоянии. Для С1--канала оно значительно больше, чем для Са2+-канала. После повторной деполяризации мембраны импульсом напряжения (Уи = 50 мВ, 1и = 250 мс) и переводе напряжения на мембране на уровень —200 мВ (равновесный потенциал для К+-каналов ) вклад в суммарный ток дают только Са2+-каналы [21]. С1--каналы в это время находятся в инактивирован-
1.4
1.0
0.6
0.2
10 15 20 25 Время, мин
30 35
Рис. 1. Изменение амплитуды Са2+- (1) и С1 -токов
(2) плазмалеммы нативной клетки C. corallina в присутствии 5 мкМ олеиновой кислоты. Приведены нормированные токовые кривые. Стрелкой указан момент введения в раствор олеиновой кислоты. Наружный раствор содержал (в мМ): 0.1 KCl, 1.0 NaCl, 1.0 CaCl2, 1.0 HEPES-трис, pH 7.3.
ном состоянии. Этот феномен достаточно наглядно проиллюстрирован нами ранее [18].
Известно, что олеиновая кислота плохо растворима в водных растворах при нейтральных значениях рН [22, 23]. Не исключено, что жирная кислота взаимодействует с плазматической мембраной клетки в виде мицеллоподобных агрегатов, как показано на примере ее комплексов с а-лактальбумином [8].
Характер влияния олеиновой кислоты на ионные каналы плазмалеммы нативной клетки С. сог-аШпа зависел от ее концентрации и времени экспозиции. Введение 5 мкМ олеиновой кислоты в раствор, омывающий рабочий участок клетки, вызывало ее неоднозначное действие на амплитуду обеих компонент интегрального тока. Если для хлорного тока было характерно постепенное уменьшение его амплитуды (рис. 1, кривая 2), то кальциевый ток значительно (до 30%) увеличивался в течение первых 5 мин после введения олеиновой кислоты с по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.