БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 3, с. 211-216
УДК 576.385.5:576.314
ОЛИГОМИЦИНЫ ПОДАВЛЯЮТ МНОЖЕСТВЕННУЮ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
© 2015 г. М. В. Бибикова1, Н. Э. Грамматикова2, А. Ф. Корыстова3, Л. Н. Кублик3, М. Х. Левитман3, В. В. Шапошникова3, Н. В. Долгих3, Ю. Н. Корыстов3*, А. В. Катлинский4
1ООО "ВИОРИН", 117105, Москва, Нагатинская ул., 3а 2ООО "ОЛФАРМ", 117105, Москва, Нагатинская ул., 3а 3Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская ул., 3; *электронная почта:ykorystov@rambler.ru 4НПО "МИКРОГЕН", 127473, Москва, 2-й Волконский пер., 10 Поступила в редакцию 30.10.2014 г.
Сравнили влияние олигомицинов ScII, F, В и циклоспорина А на множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) клеток лимфолейкоза Р388ВР и клеток рака гортани НЕр-2. Установлено, что олигомицин SdI снижает откачку родамина 123 и кальцеина АМ из клеток НЕр-2 эффективнее, чем циклоспорин А, а в клетках Р388ВР циклоспорин А был эффективнее олигомицинов. Различия в эффективности циклоспорина А и олигомицинов в клетках разного типа, по-видимому, обусловлена экспрессией в них разных транспортных белков: Pgp в Р388ВР и других белков (например, одного из семи белков семейства MRP) в НЕр-2.
Ключевые слова: олигомицины, циклоспорин А, множественная лекарственная устойчивость.
DOI: 10.7868/S0233475515020036
ВВЕДЕНИЕ
Устойчивостью к широкому классу лекарственных соединений обладают различные бактерии, простейшие, грибы и клетки млекопитающих. Один из основных факторов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) — наличие в плазматической мембране транспортных белков, использующих энергию АТР для выведения из клеток различных соединений против градиента концентраций [1, 2]. Этот процесс существенно снижает эффективность средств, используемых в терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований. Известен широкий спектр заболеваний, проведение терапии при которых осложняется, а порой и невозможно из-за МЛУ, поэтому очевидна необходимость поиска эффективных ингибиторов МЛУ. В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны в основном два типа транспортных белков — белок MRP (multidrug resistance associated protein) и гликопротеин Р (P-glycopro-tein, Pgp) [2]. MRP и Pgp обнаружены в опухолях различного происхождения: лимфомах, саркомах, раке и нейробластомах [2, 3]. В настоящее время обнаружены или синтезированы три поко-
ления ингибиторов МЛУ, эффективность которых возрастает, а побочные эффекты уменьшаются [4]. Наиболее активным из первого поколения ингибиторов МЛУ считается циклоспорин А. Второе поколение ингибиторов было создано в конце 80—начале 90 годов на основе ингибиторов первого поколения, которые изменяли с целью повышения активности и снижения побочных эффектов. Наиболее активным из ингибиторов второго поколения считается аналог циклоспорина А, не подавляющий иммунитет, — PSC 833. В концентрации 0.5—2 мкМ он подавляет МЛУ в клетках in vitro и повышает эффективность терапии опухолей мышей доксорубицином. С 1993 г. и по настоящее время синтезирован ряд соединений, проявляющих ингибирующую активность в концентрации 20—100 нМ. Наиболее эффективный ингибитор третьего поколения — циклопро-пилдибензосуберан (LY 335979) в 10 раз активнее циклоспорина А. Однако до настоящего времени не создан ингибитор МЛУ, который можно широко применять в клинике. В настоящей работе определили способность олигомицинов ScII, B и F подавлять МЛУ двух типов опухолевых клеток и сравнили ее с активностью циклоспорина А.
18 h 16 14 -12 -
S
в
о
я и
Él 10 н
е я
о
е р
о ^
ч О
8
6 I-
4 -
02
6 8 10 12 14 16 18 20 Время, мин
Рис. 1. Образование кальцеина в клетках Р388ВР из 7-суточной опухоли в контроле (1) и после добавления циклоспорина А, 0.8 мкМ (2). VI = 0.25, V2 = 1.65. К = 6.6. VI, V2 — скорости образования кальцеина в контроле и в присутствии циклоспорина А соответственно, определенные по наклону прямых образования кальцеина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Лимфолейкоз Р388 перевивали на мышах DBA2. Устойчивый к винкристину (Gedeon Richter, Венгрия) штамм Р388ВР получали путем 6-кратного введения в винкристина (1 мкг/г) в брюшную полость мышей через сутки после прививки опухоли. Устойчивость к винкристину штамма Р388ВР обусловлена сверхэкспрессией Pgp [5].
Для изучения действия олигомицинов на МЛУ клеток Р388ВР определяли скорость откачки из клеток двух субстратов транспортных белков: ацетооксиметилового эфира кальцеина — кальцеина АМ (Molecular Probes, США) и родамина 123 — R123 (ICN, США). Транспорт из клеток кальцеина АМ определяли по методике [6]. Известно, что нефлуоресцирующий кальцеин АМ входит в клетки по градиенту концентрации, где под действием внутриклеточных эстераз превращается во флуоресцирующий кальцеин. Эфир кальцеина откачивается из клеток транспортными белками Pgp и MRP, ответственными за МЛУ. Соответственно, скорость образования кальцеина тем меньше, чем больше в клетках Pgp и MRP. Скорость образования кальцеина в клетках, регистрируемая по увеличению его флуоресценции в кювете, зависит также от концентрации кальцеина АМ и концентрации клеток [7], поэтому она не может характеризовать ни МЛУ, ни эффект ингибиторов. Количественно эффект ингибитора характеризуется коэффициентом увеличения скорости образования кальцеина при действии ингибитора в различных концентрациях. Ингибиторы сравнивают по максимальному коэффициенту
подавления скорости образования кальцеина и по концентрации, при которой коэффициент равен половине максимального. Скорость образования кальцеина определяли следующим образом. В кювету помещали 3 мл раствора Хэнкса (37°C) с добавлением 0.5% эмбриональной сыворотки, затем добавляли 500 тысяч клеток и определяли базовый уровень флуоресценции. Кинетику образования кальцеина регистрировали после добавления к клеткам 100 нм кальцеина АМ (Molecular Probes, США) при постоянном перемешивании на спектрофотометре Perkin-Elmer MF44, длины волн эмиссии и поглощения 493 и 515 нм соответственно. После записи скорости образования кальцеина в контроле в кювету добавляли олигомицины в разной концентрации и измеряли изменение скорости образования кальцеина. Коэффициент ингибирования МЛУ (K) определялся отношением скоростей в присутствии ингибитора и без него. В каждом опыте определяли максимальное значение K по влиянию известного ингибитора МЛУ циклоспорина А (1 мкг/мл, 0.8 мкМ) (Sigma, США) на скорость образования кальцеина. На рис. 1 приведены результаты одного из опытов по образованию кальцеина в клетках в контроле и после добавления циклоспорина А.
Транспорт родамина 123 из клеток Р388ВР определяли с помощью проточного цитометра (Partee, Германия). Клетки в течение 1 ч нагружали родамином 123 (0.5 мкг/мл) с циклоспорином А (1 мкг/мл). Затем клетки отмывали от родамина 123 (2 раза в растворе Хэнкса с 1% сыворотки), часть клеток ставили в термостат (37°C) на 40 мин для определения выхода из клеток родамина 123 с ингибиторами или без них. На проточном цито-метре определяли распределение клеток по содержанию родамина 123 и среднее количество в клетках родамина по его флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 488 и 520 нм соответственно. Анализировали 100 тысяч клеток и более на каждую гистограмму.
Транспорт родамина 123 из клеток рака гортани человека — HEp-2, определяли по методике, разработанной экспериментально и обоснованной теоретически в работе [8]. Метод применим только для клеток, прикрепляющихся к субстрату. Было показано, что отношение скоростей выхода R123 из клеток в норме и при полном подавлении активного транспорта минус единица: (R — 1)max равно отношению активного и пассивного транспорта и, следовательно, характеризует активность в клетках белков, обеспечивающих МЛУ. По 1— 1.5 млн клеток HEp-2 высевали в среде DMEM (Sigma, США) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США) и гентамицином на пластинки (50 х 9 х 2 мм), помещенные в чашки диаметром 6 см, объем среды 8 мл. Инкубировали в СО2-инкубаторе. Через 1 сут инкубации в СО2-ин-
2
4
ОЛИГОМИЦИНЫ ПОДАВЛЯЮТ
213
кубаторе при 37°C клетки отмывали в среде RPMI1640 (Sigma, США) и нагружали их R123 (0.5 мкг/мл) в присутствии ингибитора транспортных белков, циклоспорина А, 3 мкг/мл (2.4 мкМ) в среде RPMI1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки, в течение 60 мин при 37°C. После инкубации клетки трижды (по 10 мин) отмывали от красителя и циклоспорина А холодным (2°C) физиологическим раствором с 1% эмбриональной сывороткой теленка. После отмывания и до момента измерения пластинки с клетками хранили в растворе Хэнкса с 0.5% сыворотки на льду. Отмытую пластинку с клетками ставили в кювету спектрофотометра MF44 Perkin-Elmer с раствором Хэнкса и 0.5% эмбриональной сывороткой (объем 3 мл, 37°C) и определяли увеличение количества R123 в среде при постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и эмиссии 488 и 520 нм соответственно. В конце эксперимента клетки, для определения в них максимального количества R123, разрушали, добавляя в кювету 0.02% дигитонина (Sigma, США). На рис. 2 приведен пример выхода из клеток родамина 123 в норме (1), в присутствии циклоспорина А (2) и после добавления дигитонина, а на рис. 3 показана кинетика выхода родамина 123 из клеток в норме и в присутствии циклоспорина А. Как видно на рис. 3, количество родамина 123 в клетках в контроле и после добавления ингибитора уменьшается экспоненциально, поскольку в полулогарифмическом масштабе эти кинетики описываются прямыми линиями. Циклоспорин А (0.8 мкМ) в данном опыте в 2.9 раза снижал константу скорости выхода родамина 123: коэффициент ингиби-рования активного транспорта родамина 123 из клеток — R в данном случае равен 2.9.
Для определения транспорта из клеток HEp-2 кальцеина АМ клетки, прикрепленные к субстрату, инкубировали с кальцеином АМ (100 нМ) с ингибиторами или без них в течение 1 ч при 37°C в ростовой среде. Затем клетки отмывали от каль-цеина АМ холодной средой HPMI (Sigma, США) с пониженным содержанием Са2+, открепляли от стекла скрепером и помещ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.