научная статья по теме ОЛИГОМИЦИНЫ SCII И В ПОДАВЛЯЮТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ВЫЗЫВАЮТ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК ЛИМФОЛЕЙКОЗА P388 И ШТАММА, УСТОЙЧИВОГО К ВИНКРИСТИНУ Биология

Текст научной статьи на тему «ОЛИГОМИЦИНЫ SCII И В ПОДАВЛЯЮТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ВЫЗЫВАЮТ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК ЛИМФОЛЕЙКОЗА P388 И ШТАММА, УСТОЙЧИВОГО К ВИНКРИСТИНУ»

УДК 576.385.5:576.314

ОЛИГОМИЦИНЫ SCП И В ПОДАВЛЯЮТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ВЫЗЫВАЮТ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК ЛИМФОЛЕЙКОЗА P388 И ШТАММА, УСТОЙЧИВОГО К ВИНКРИСТИНУ

© 2015 г. М. В. Бибикова1, Н. Э. Грамматикова2, А. В. Катлинский3, А. Ф. Корыстова4, Л. Н. Кублик4, М. Х. Левитман4, В. В. Шапошникова4, Ю. Н. Корыстов4*

1ООО "ВИОРИН", 117105, Москва, Нагатинская 3а 2ООО "ОЛФАРМ", 117105, Москва, Нагатинская 3а 3НПО "МИКРОГЕН", 127473, Москва, 2-й Волконский переулок 10 4Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская 3; *электронная почта:ykorystov@rambler.ru Поступила в редакцию 30.10.2014 г.

Исследовали действие олигомицинов £СП и В на пролиферацию и апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 и штамма, устойчивого к винкристину. Показано, что оба олигомицина в низких концентрациях: олигомицин В — до 0.3, олигомицин £СП — до 1 нг/мл подавляют пролиферацию клеток. В больших концентрациях олигомицины вызывают гибель клеток по типу апоптоза, причем чувствительность к олигомицинам клеток дикого типа и штамма, устойчивого к винкристину, одинакова. Олигомицин В в 3 раза более эффективно снижал выживаемости клеток, чем олигомицин £СП: 1С50 составляет 3 и 10 нг/мл соответственно. Одинаковая чувствительность к олигомицинам клеток дикого типа и штамма, устойчивого к винкристину, объясняется тем, что олигомицины ингибируют множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, что показано по увеличению скорости образования кальцеина из ацетооксиметилового эфира кальцеина в клетках устойчивого штамма.

Ключевые слова: олигомицины SCII и B, пролиферация, апоптоз, множественная лекарственная устойчивость, лимфолейкоз Р388.

Б01: 10.7868/80233475515020024

ВВЕДЕНИЕ

Образование комплекса олигомицинов А, В, С культурой Streptomyces diastatochromogenes было описано еще в 1954 г. В дальнейшем обнаружили и другие близкие антибиотики, общим элементом структуры которых являются близкие макролидные агликоны. Все известные антибиотики этой группы проявляют цитостатическую активность в отношении трансформированных клеток, несколько меньшую в отношении нормальных клеток, а также антигрибную, антипаразитарную, иммуносупрессор-ную, противовирусную активности. Механизм действия этой группы антибиотиков связан с инги-бированием активности Б^-АГР-азы и окислительного фосфорилирования. Ведутся работы по получению и изучению механизма действия как природных аналогов олигомицинов, так и их полусинтетических производных [1—3]. В процессе поиска природных соединений с гиполипидеми-ческой активностью нами был выделен штамм

S. Virginia 17, продуцирующий комплекс олигомицинов, один из компонентов которых — новый антибиотик олигомицин SCII [2]. В представленной работе изучено влияние олигомицинов SCII и В на пролиферацию и апоптоз клеток лимфолейкоза Р388 дикого типа и штамма, устойчивого к винкристину.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки Р388 выращивали в брюшной полости мышей DBA2. Резистентные к винкристину клетки Р388 получали, выращивая их в мышах-самцах DBA2 при воздействии 1 мкг/г винкристина (Gedeon Richter, Венгрия). Винкристин вводили внутрибрюшинно через 1 сут после прививки опухоли (106 клеток на мышь). После нарастания клеток их перевивали и снова вводили 1 мкг/г винкристина. Процедуру повторяли 6 раз. Полученный штамм клеток обозначили Р388ВР (вин-кристин-резистентный). Известно, что при се-

1 10 100 1000

Винкристин, нМ

Рис. 1. Влияние винкристина на выживаемость клеток Р388 (1) и Р388ВР (2). IC50 для 1 - 12, 2 - 510 нМ.

лекции клеток Р388 на устойчивость к винкри-стину получается штамм, устойчивый за счет сверхэкспрессии Р-гликопротеина [4].

Оба типа клеток извлекали из брюшной полости мышей через 7 сут после прививки, отмывали раствором Хэнкса и помещали в среду RPMI1640 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 40 мкг/мл гентами-цина (Sigma) при концентрации клеток 106/мл. Исследуемые агенты добавляли перед инкубацией. Клетки инкубировали при концентрации 1.5 х 106/мл 22 ч в атмосфере 5% СО2 при 37°C. После инкубации долю погибших клеток определяли, используя окрашивание 0.04% трипановым синим (Sigma). Вычисляли выживаемость клеток по формуле: В, % = N/N0 х 100%, где N и N0 - доля живых клеток в опыте и контроле соответственно.

Повреждение ядер оценивали по конденсации хроматина (пикноз) и фрагментации конденсированного хроматина (фрагментация ядра). Клетки фиксировали смесью уксусной кислоты с этанолом (1 : 3) и окрашивали по Гимза. Частоту повреждения ядер оценивали под микроскопом при 600-кратном увеличении, подсчитывая по 500 клеток на препарате.

Распределение клеток по содержанию ДНК анализировали методом проточной цитометрии. Клетки фиксировали 70% этанолом, переносили в фосфатный буфер (рН 7.2) и окрашивали красителем Hoechst 33258 (Serva, Германия) в концентрации 2 мкг/мл в течение 5 мин. Флуоресценцию возбуждали излучением с X = 450 нм. Гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК строили по результатам измерения 20-50 тысяч клеток. Апоптозными считали клетки с субдиплоидным набором ДНК — суб. G1.

Действие олигомицинов на множественную устойчивость (МЛУ) клеток Р388ВР определяли по изменению скорости образования кальцеина из эфира кальцеина при действии ингибиторов МЛУ. За основу была взята методика [5]. Известно, что не флуоресцирующий ацетоксиметило-вый эфир кальцеина (кальцеин АМ) входит в клетки по градиенту концентрации, где под действием внутриклеточных эстераз превращается в флуоресцирующий кальцеин. Эфир кальцеина откачивается из клеток транспортными белками Pgp и MRP, ответственными за МЛУ. Соответственно скорость образования кальцеина тем меньше, чем больше количество Pgp и MRP в клетках. Скорость образования кальцеина в клетках, регистрируемая по увеличению его флуоресценции в кювете, зависит также от концентрации кальцеина АМ и концентрации клеток [6], поэтому сама по себе не может характеризовать ни МЛУ, ни эффект ингибиторов. Количественно эффект ингибитора характеризуется коэффициентом увеличения скорости образования кальце-ина при действии разных концентраций ингибитора. Разные ингибиторы сравниваются по максимальному коэффициенту подавления скорости и по концентрации, при которой коэффициент равен половине максимального. Скорость образования кальцеина определяли следующим образом. Клетки Р388ВР выделяли из брюшной полости мышей DBA2 и отмывали в растворе Хэнкса. В кювету помещали 3 мл раствора Хэнкса (37°C) с добавлением 0.5% эмбриональной сыворотки, а затем 500 тысяч клеток и определяли базовый уровень флуоресценции. Кинетику образования кальцеина в клетках регистрировали после добавления к клеткам 100 нм кальцеина АМ (Molecular Probes, США) при постоянном перемешивании на спектрофотометре Perkin-Elmer MF44, длины волн эмиссии и поглощения 493 и 515 нм соответственно. После записи скорости образования кальцеина в контроле в кювету добавляли олиго-мицины в разной концентрации и измеряли изменение скорости образования кальцеина. Коэффициент ингибирования МЛУ (К) определялся по соотношению скоростей в присутствии ингибитора и без него. В каждом опыте максимальное значение К определяли по эффекту на скорость образования кальцеина известного ингибитора МЛУ — циклоспорина А, 1 мкг/мл.

Для опытов, выполненных в трех и более по-вторностях, определяли квадратичную ошибку среднего значения (ошибка указана на рисунках).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлены данные, показывающие как винкристин влияет на клетки Р388 и Р388ВР. Видно, что штамм Р388ВР намного устойчивее к винкристину, чем клетки дикого ти-

ОЛИГОМИЦИНЫ SCII И В

137

100 г

90

80

70

60

50

40

30

20 10

10

10-2 10-1 1 10 102 Концентрация, нг/мл

103 10

4

100

80 -

60 -

à 40

20

10-5 10-4 10

10-2 10-1 1 10 102 Концентрация, нг/мл

i-Lüiii........*

103 104

Рис. 2. Влияние олигомицина SCII на выживаемость 7-суточных клеток Р388 (1) и Р388ВР (2). 3 — усредненные данные. IC50 = 10 нг/мл.

Рис. 3. Влияние олигомицина В на выживаемость 7-суточных клеток Р388 (1) и Р388ВР (2). 3 — усредненные данные. 1С50 = 3 нг/мл.

па: величина IC50 у резистентного штамма в 43 раза больше. Штамм Р388, устойчивый к винкристину, характеризуется сверхэкспрессией Р-гликопроте-ина и устойчивостью к другим противоопухолевым препаратам [4]. Если олигомицины являются субстратами Р-гликопротеина, то штамм Р388ВР может быть более устойчивым и к ним, чем клетки дикого типа. На рис. 2 показано влияние олигомицина SCII, а на рис. 3 — олигомицина В на клетки Р388 и Р388ВР. Видно, что оба олигомицина одинаково эффективны на клетках дикого типа и устойчивых к винкристину штаммах. Олиго-мицин В в 3 раза более эффективно снижает выживаемость клеток, чем олигомицин SCII: IC50 составляет 3 и 10 нг/мл соответственно. В низких концентрациях оба олигомицина (олигомицин В до 0.3, а SCII до 1 нг/мл) снижают выживаемость клеток примерно на 20%. Этот эффект обусловлен подавлением пролиферации, поскольку именно на эту величину увеличивается количество клеток в контроле при инкубации в течение 22 ч. При увеличении концентрации олигомици-нов выживаемость снижется уже за счет гибели клеток. Появляются клетки, окрашенные трипа-новым синим, и уменьшается их количество за счет лизиса.

Опухолевые клетки погибают в основном по типу некроза или апоптоза. При апоптозе в клетках выявляются такие специфические морфологические изменения, как конденсация хроматина и фрагментация ядра, появляются клетки с гипо-диплоидным количеством ДНК. Оба типа повреждений обусловлены межнуклеосомной фрагментацией ДНК и выбросом фрагментов из клеток, что происходит только при апоптозе. Окрашивание клеток и их лизис наблюдаются и при апопто-

зе, но это вторичное явление, в отличие от некроза. Для определения типа гибели клеток под действием олигомицинов исследовали изменение ядер клеток и распределение клеток по содержанию ДНК.

На рис. 4 представлены результаты изучения влияния олигомицинов на повреждение ядер клеток Р388. В контроле число поврежденных ядер составило примерно 11%. Олигомицин В в концентрации до 1 нг/мл не вызывает у

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»