БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 309 - 319
УДК 576.316.24
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ТЕЛОМЕРАЗЫ: ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Обзор
© 2015 М.Э. Зверева12, Т.С. Зацепин13, Д.М. Ажибек3, О.С. Шубернецкая1,3, О.В. Шпанченко1*, О.А. Донцова1,2
1 Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; электронная почта: olgash@genebee.msu.ru
2 Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
3 Сколковский институт науки и технологий, 143025Московская обл., Одинцовский р-н, Новоивановское
городское поселение, дер. Сколково, ул. Новая, 100
Поступила в редакцию 23.10.14 После доработки 14.11.14
Работа теломеразы позволяет эукариотическим клеткам приобрести неограниченный потенциал к делению. В процессе функционирования теломераза синтезирует короткие ДНК-повторы на 3'-конце ДНК в составе хромосом, что обеспечивает стабильность генома при делении клеток. Теломераза активна в большинстве типов раковых клеток и, за редким исключением, практически отсутствует в соматических клетках. Такое различие позволяет рассматривать ингибирование активности теломеразы в качестве возможного подхода для противоопухолевой терапии. Теломераза является нуклеопротеином и состоит из двух основных компонентов: каталитической субъединицы, являющейся обратной транскриптазой (hTERT), и тело-меразной РНК (hTR), кодирующей матрицу для синтеза повторов. Биогенез и свойства теломеразы открывают широкие возможности для ее ингибирования за счет комплементарных взаимодействий. В данном обзоре проанализированы предполагаемые пути воздействия олигонуклеотидов на теломеразу, рассмотрены известные ингибиторы теломеразы олигонуклеотидной природы и показаны возможные механизмы их действия. Кроме того, обсуждается применение конъюгатов олигонуклеотидов для визуализации опухолевых клеток in vivo.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: теломераза человека, ингибиторы теломеразы, мишень антираковой терапии, олиго-нуклеотид, визуализация опухолевых клеток.
Теломераза — сложный РНК-белковый комплекс, который удлиняет 3'-выступающие концы хромосомной ДНК путем добавления теломер-ных повторов, что препятствует укорочению хромосом в процессе репликации и обеспечивает неограниченный потенциал деления клеток [1]. Известно, что теломераза активна в эмбриональных, стволовых и половых клетках, в ряде клеток
Принятые сокращения: ИТЯ — теломеразная РНК человека; ИТБЯТ — обратная транскриптаза теломеразы человека; 2'-МОЕ — 2'-метоксиэтилрибоолигонуклеотиды; ПНК — пептидо-нуклеиновые кислоты; МСК — мезенхи-мальные стволовые клетки.
* Адресат для корреспонденции.
с высоким пролиферативным потенциалом [2] и, главное, в раковых клетках [3]. Раньше активность теломеразы рассматривалась как однозначный фактор, позволяющий отличить раковые клетки от нормальных, поскольку в большинстве типов клеток злокачественных опухолей активность теломеразы значительно выше, чем в нормальных тканях. На сегодня показано, что роль теломеразы в клетке не ограничивается только компенсацией репликативного укорочения тело-мер, связанного с клеточным старением, каталитическая субъединица теломеразы защищает ми-тохондриальную ДНК от повреждений [4]. Таким образом, теломераза является перспективной мишенью для противораковой терапии.
С другой стороны, кратковременная активация теломеразы может рассматриваться как возможность противостоять клеточному старению [5], поэтому поиск активаторов и регуляторов активности теломеразы — не менее перспективная задача, чем поиск ее ингибиторов. Однако работ, посвященных поиску активаторов тело-меразы олигонуклеотидной природы, в литературе мы не нашли. К настоящему моменту описан лишь защищенный патентом низкомолекулярный теломеразный активатор растительной природы ТА-65 [6].
Использование ингибиторов теломеразы может сопровождаться побочными эффектами, затрагивающими, в первую очередь, стволовые клетки, в которых теломераза активна и необходима для поддержания регенеративного потенциала и жизнеспособности. Несмотря на это, различные подходы к ингибированию теломе-разы разрабатываются уже более десяти лет [7]. Большинство ингибиторов теломеразы — это низкомолекулярные соединения, которые стабилизируют О-квадруплексы и препятствуют взаимодействию теломеразы с ДНК.
В состав теломеразного комплекса в качестве основных компонентов входят каталитическая субъединица, являющаяся обратной транс-криптазой (МЕЯТ), и теломеразная РНК ИТЯ, которая содержит матричный участок для синтеза теломерных повторов. Кроме того, для функционирования теломеразы в клетке необходимы связывание дополнительных регулятор-ных белков и доступность субстрата — З'-конце-вых участков теломер [1]. Таким образом, инги-бировать активность или блокировать работу те-ломеразы можно, влияя на биосинтез, созревание, сборку или корректное взаимодействие между компонентами теломеразы или на взаимодействие теломеразного комплекса с субстратом. На схеме представлены основные этапы, на которых можно заблокировать функционирование теломеразы при помощи олигонуклеотид-ных ингибиторов, и мишени для их воздействия. Основными мишенями являются процессы, связанные с транскрипцией генов НТЕКГ (схема, 1—3) и НТЯ (4, 5), а также нарушение сборки теломеразного комплекса (6), блокирование ферментативной активности собранного теломеразного комплекса (7), потеря концами теломер доступности для взаимодействия с те-ломеразой (8) и ингибирование активности те-ломеразного комплекса, взаимодействующего с теломерами (9).
Недавно ряд ингибиторов теломеразы перешел в стадию клинических испытаний, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования ингибиторов теломе-
разы в качестве химиотерапевтических препаратов [8]. В данном обзоре нами будет рассмотрено ингибирование теломеразы олигонуклеоти-дами [9] на основе комплементарных взаимодействий как с теломеразной РНК, так и с мРНК теломеразных белков и, в первую очередь, каталитической субъединицей теломеразы. Комплексное использование различных подходов может увеличить эффективность ингибиро-вания теломеразы.
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ТЕЛОМЕРАЗЫ
Олигонуклеотиды являются эффективными инструментами в молекулярной диагностике [10] и функциональной геномике [11], а главное, рассматриваются как перспективные терапевтические средства [12]. Технологии регулирования клеточных процессов на основе олиго-нуклеотидов продемонстрировали свою эффективность in vitro и in vivo [13, 14]. На сегодняшний день используются различные подходы: антисмысловая технология, РНК-интерференция, аптамеры, анти-микроРНК, CRISPR и др. Основные проблемы, возникающие при использовании олигонуклеотидов в качестве терапевтических агентов, сопряжены с их низкой стабильностью in vivo и сложностью их селективной доставки в ткани и клетки [15]. Химически модифицированные олигонуклеотиды существенно стабильнее и более эффективно проникают в клетки при сохранении биологической активности [16]. Присоединение различных лигандов позволяет добиться специфичности доставки конъюгатов в определенные клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза [17].
При создании олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы были использованы различные модификации сахарофосфатного остова. На сегодняшний день в литературе описаны 2'-0-ал-килрибонуклеотиды и олигонуклеотиды с тио-фосфатной, фосфамидной и тиофосфамидной межнуклеотидными связями, а также пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) [18].
2'-0-Метил- и 2'-0-метоксиэтил-модифици-рованные олигонуклеотиды [19] образуют более стабильные дуплексы с комплементарными мишенями и ингибируют теломеразу уже в наномо-лярных концентрациях [20]. 2'-МОЕ-модифи-кации, кроме значительной стабилизации дуплекса, также способствуют улучшению фарма-кокинетики олигомера.
Тиофосфатные олигонуклеотиды — самый распространенный тип модифицированных олигонуклеотидов [21], также были использова-
ны для ингибирования теломеразы. Они имеют высокую нуклеазную стабильность. Однако попытка их использования для ингибирования теломеразы выявила низкую специфичность. Так, тиофосфатный олигонуклеотид S-ODNS инги-бирует теломеразу за счет связывания с белком hTERT, а не с РНК [22]. Более того, было показано, что 20-звенный тиофосфатный олигонук-
леотид ингибирует теломеразу независимо от нуклеотидной последовательности [23]. Из-за неспецифического связывания с белками такие олигонуклеотиды являются иммуностимулирующими [24]. Таким образом, перспективным для ингибирования теломеразы представляется использование олигонуклеотидов с небольшим количеством тиофосфатных модификаций, что
Олигонуклеотидные ингибиторы теломеразы: 1 — ингибирование транскрипции гена hTERT; 2 — перенаправление сплайсинга мРНК hTERT в сторону альтернативных форм, не кодирующих белок или кодирующих неактивный белок; 3 — деградация первичного транскрипта и зрелой формы мРНК hTERT; 4 — ингибирование транскрипции гена hTR; 5 — деградация первичного транскрипта и нарушение созревания первичного транскрипта hTR; 6 — нарушение сборки теломеразного комплекса; 7 — блокирование ферментативной активности собранного теломеразного комплекса; 8 — уменьшение доступности концов теломер для теломеразы; 9 — ингибирование теломеразного комплекса, взаимодействующего с тело-мерами
позволит сохранить специфичность при увеличении нуклеазной стабильности.
В фосфамидных олигонуклеотидах атом кислорода в З'-положении углеводного остатка заменен на атом азота [25]. Такие олигонуклео-тиды образуют более стабильный дуплекс с комплементарной мишенью по сравнению с природными ДНК и при этом сохраняют специфичность. Следует отметить, что дуплексы таких олигонуклеотидов с РНК не являются субстратами РНКазы Н. Тиофосфамидные оли-гонуклеотиды более стабильны к действию нук-леаз, чем фосфамидные олигонуклеотиды, что приводит к заметному увеличению ингибирова-ния теломеразы [26]. Наиболее известный ингибитор этого класса — конъюгат тиофосфамидно-го олигонуклеотида с пальмитиновой кислотой (GRN
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.