ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 433, № 4, с. 555-558
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
ОЛИГОСИЛОКСАНОВЫЕ ОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ ХОЛИНЭСТЕРАЗ НЕКОТОРЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
© 2010 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 14.09.2009 г. Поступило 24.09.2009 г.
Среди многочисленных обратимых ингибиторов холинэстераз (ХЭ) [1, 2] важное место занимает обширная группа бисониевых соединений, выделяющихся эффективностью и высокой специфичностью действия [3]. Варьирование структуры бисониевых ингибиторов идет как по пути тестирования различных по природе ониевых атомов [4], так и строения и конформации меж-ониевойцепи [2, 3, 5]. В последние годы широкий интерес представили исследования кремний-органических бисониевых силоксановых соединений, синтез которых осуществляли представители школы академика М.Г. Воронкова [6, 7]. Эти соединения оказались достаточно эффективными обратимыми ингибиторами ХЭ и обладали неожиданно высокой избирательностью действия по отношению к сывороточной бутирил-ХЭ [6].
Настоящее исследование посвящено тестированию а, 0-5ис(триметиламмониометил)-олиго-диметилсилоксанов
(CH3)3N+CH2[Si(CH3)2O]BSi(CH3)2CH2N+(CH3)3 ■ ■ 2Cl , n = 1—4, в качестве обратимых ингибиторов ХЭ млекопитающих (ацетил-ХЭ эритроцитов человека и бутирил-ХЭ сыворотки крови лошади), травяной лягушки Rana temporaria, а также двух видов кальмаров, обитающих в северо-западной акватории Тихого океана (тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus и командорского кальмара Berryteuthis magister).
В качестве источников ферментов использовали частично очищенные препараты ацетил-ХЭ эритроцитов человека (АХЭ, НФ 3.1.1.7) и бути-рил-ХЭ сыворотки крови лошади (БХЭ, НФ 3.1.1.8) с удельной активностью соответственно 1.2 и 9.6 ед. (Пермский НИИ вакцин и сывороток) [8], водный гомогенат ткани мозга лягушки R. temporaria (45 мг/мл) [8], центрифугаты (800g, 15 мин) водных гомогенатов (3 мг/мл) ткани зрительного ганглия половозрелых особей обоего пола тихоокеанского кальмара T. pacificus [8] и
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
командорского кальмара В. та§!з1ег [9]. В случае командорского кальмара В. та§!з1ег были исследованы по 5—6 особей из разных зон ареала обитания: в Беринговом море — Прибылово-Аляскинский район (56—58° с.ш., 171—177° з.д.) (зона 1) и Олюторо-Наваринский район (60—61° с.ш., 173—179° в.д.) (зона 2), а также в акватории Центральных Курильских островов (47° с.ш., 152° в.д.) (зона 3) [9]. Каталитическую активность ХЭ определяли при 25°С и рН 7.5 колориметрическим методом Эллманна [10]. Субстратом был ацетил-тиохолиниодид ("СИетаро1"). Об эффективности обратимых ингибиторов судили по величине
обобщенной ингибиторной константы (К), которая при смешанном типе торможения взаимосвязана с конкурентной (К) и бесконкурентной
(К) составляющими согласно формуле = = — +
К К
+ -- [13]. Для определения величин К и К] измеряли величины начальной скорости ферментативной реакции в широком интервале концентраций ацетилтиохолина, включая равную величине константы Михаэлиса, в отсутствие и в присутствии разных концентраций ингибитора. Величины ингибиторных констант вычисляли
графически [1] и выражали в виде р К = — ^ К и т.д. По соотношению величин рК и рК] определяли тип торможения: конкурентный (р К] ^ 0), смешанный (рК-- > р К]), неконкурентный (рК-- =
= р К) [1].
Можно было ожидать [5—7], что введение в меж-ониевую цепочку диметилсилоксановых группировок должно существенно менять конформаци-онные характеристики соединений, что подтвердилось на примере соединения 2 [2, 5]. На основании данных конформационного анализа было установлено, как распределяются в единичных интервалах (Я = ±0.5 А) длины межониевой цепи устойчивые конформеры соединения 2 по своему
Таблица 1. Антихолинэстеразная эффективность соединений (CH3)3N+CH2[Si(CH3)2O]nSi(CH3)2CH2N+(CH3)3 • 2Cl-
Ингибитор Источник фермента Параметр
№ соединения структура pKi PK P K T
1 n = 1 АХЭ эритроцитов человека 3.92 3.92 - K
БХЭ сыворотки лошади 5.63 5.17 5.45 H
ХЭ мозга лягушки R. temporaria 4.00 3.85 3.47 C
ХЭ кальмара T. pacificus 4.03 3.82 3.48 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 1 3.67 3.58 2.60 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 2 3.53 3.53 - K
ХЭ кальмара B. magister, зона 3 3.72 3.62 2.60 C
2 n = 2 АХЭ эритроцитов человека 4.82 4.82 - K
БХЭ сыворотки лошади 7.27 7.06 6.85 H
ХЭ мозга лягушки R. temporaria 3.70 3.70 - K
ХЭ кальмара T. pacificus 4.93 4.74 4.48 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 1 4.27 4.18 3.50 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 2 4.63 4.53 3.80 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 3 4.32 4.22 3.52 C
3 n = 3 АХЭ эритроцитов человека 5.34 5.34 - K
БХЭ сыворотки лошади 7.77 7.34 7.56 H
ХЭ мозга лягушки R. temporaria 3.92 3.92 - K
ХЭ кальмара T. pacificus 4.92 4.77 4.39 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 1 5.07 5.03 4.42 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 2 5.53 5.43 4.68 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 3 5.12 5.02 4.40 C
4 n = 4 АХЭ эритроцитов человека 5.38 5.28 4.70 C
БХЭ сыворотки лошади 7.41 7.31 6.74 C
ХЭ мозга лягушки R. temporaria 4.27 4.23 3.11 C
ХЭ кальмара T. pacificus 4.86 4.77 3.80 C
ХЭ кальмара B. magister, зона 1 4.37 4.18 4.03 H
ХЭ кальмара B. magister, зона 2 5.03 5.03 - K
ХЭ кальмара B. magister, зона 3 4.52 4.22 4.02 H
Примечание. рК], рК;, рК — отрицательный логарифм обобщенной ингибиторной константы и ее конкурентной и бесконкурентной производных; Т — тип тормозящего действия: К — конкурентный, С — смешанный, Н — неконкурентный. Координаты зон обитания см. в тексте.
числу и по заселенности [5]. Для силоксанового производного (соединение 2) характерна 70%-ная заселенность только одного единичного интервала 9 А, соответствующего полусвернутым структурам, причем этот интервал включает чуть больше 50% возможных устойчивых конформеров соединения 2. Это свидетельствует, во-первых, о том, что наличие олигомерной диметилсилокса-новой межониевой цепи придает молекуле большую жесткость. Во-вторых, включение в цепь электроноакцепторных атомов О делает молекулу ингибитора более полярной. В-третьих, расположение метильных групп по одну сторону силокса-
новой цепи, препятствуя существованию полностью вытянутой конформации, вероятно, может придать асимметрию гидратной оболочке [5].
Все тестированные соединения оказались обратимыми ингибиторами изученных ХЭ: 1) их эффективность не зависела от времени инкубации с ферментами; 2) степень ингибирующего действия существенно снижалась при разбавлении реакционной смеси. Обе эти характеристики являются необходимыми и достаточными критериями для идентификации обратимого характера торможения [1, 2].
ОЛИГОСИЛОКСАНОВЫЕ ОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ
557
Данные табл. 1 свидетельствуют, что по отношению к "реперным" ХЭ млекопитающих (АХЭ и БХЭ) тестированные соединения 1-4 проявили себя как эффективные обратимые ингибиторы, причем чувствительность БХЭ была во всех случаях существенно выше, чем АХЭ. Так, для соединения 1 преимущество БХЭ было в 85 раз, а для соединения 3 — в 340 раз. Силоксановые производные оказались высокоспецифическими ингибиторами БХЭ по величинам как обобщенной
константы K, так и ее конкурентной составляющей K. Однако, так как в случае АХЭ для силок-сановых производных наблюдался главным образом конкурентный тип торможения, а в случае БХЭ - неконкурентный, то специфичность действия в большей мере проявлялась по величинам
обобщенной константы K¡. В зависимости анти-холинэстеразной эффективности от структуры ингибиторов отмечена четкая тенденция для си-локсановых производных возрастания по мере увеличения звеньев межониевой цепи, причем наиболее сильным ингибитором обеих ХЭ оказалось соединение 3 (n = 3), которое тормозило активность АХЭ и БХЭ соответственно в 25 и 140 раз сильнее, чем соединение 1 (n = 1), причем соединение 4 оказалось несколько слабее лишь в случае БХЭ. Эта зависимость для силоксановых производных была иной, чем в ряду полиметилен-бис(триметиламмония) [11], по-видимому, за счет существенных физико-химических и конформа-ционных различий между олигосилоксановой и полиметиленовой межониевыми цепями.
Данные табл. 1 выявили своеобразие свойств ХЭ лягушки R. temporaria по сравнению с АХЭ, к типу которой этот фермент должен принадлежать как ХЭ мозга [1, 2]. Если для соединения 1 чувствительности АХЭ и ХЭ лягушки соизмеримы, то остальные ингибиторы силоксанового ряда должны оказаться на порядок более сильными по отношению к АХЭ. Кроме того, в случае ХЭ лягушки практически нет зависимости антихо-линэстеразной эффективности соединений 1—4 от их структуры. Пожалуй, единственным сходством с АХЭ является преимущественно конкурентный тип торможения ХЭ лягушки под действием силоксановых ингибиторов.
И, наконец, группа ХЭ кальмаров тихоокеанского T. pacificus и командорского B. magister. — это два промысловых вида, имеющие достаточно близкие ареалы обитания в северо-западной Па-цифике, но существенно различающиеся по поведенческой динамике [12, 13]. Так, T. pacificus очень мобилен и характерные для него сезонные популяции не проявляют между собой различий по основным биологическим параметрам, в том числе и по энзимологическим характеристикам ХЭ зрительных ганглиев [8, 13]. В противополож-
ность тихоокеанскому командорский кальмар B. magister относительно малоподвижен, для него характерны популяционные скопления в определенных зонах обитания, которые рассматриваются в ранге подвидов [9, 12, 13]. Это подтверждается различиями энзимологических характеристик ХЭ зрительных ганглиев особей B. magister. Поэтому мы тестировали ХЭ особей B. magister из трех зон обитания.
При взаимодействии с ингибиторами силокса-нового ряда у ХЭ кальмаров обнаружены отличия от ХЭ позвоночных и различия между собой. ХЭ кальмаров по своей чувствительности ко всем членам ряда существенно уступали БХЭ, а в случае соединений 3 и 4 — также и АХЭ. Характер зависимости "структура—активность" был иным, чем у "реперных" ферментов, и не напом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.