механизмы модификационнои ИЗМЕНЧИВОСТИ 79
УДК 575.2: 663.12
© А. А. Нижников 1 3. М. Магомедова ', А. Ф. Сайфитдинова ', С. Г. Инге-Вечтомов 2, А. П. Галкин 2
'Санкт-Петербургский государст венный университет, кафедра генетики и селекции 2Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
Ш Ранее мы показали, что делеция последовательности, кодирующей 11-терминальный домен гена БиРЗБ, создает генетический фон, позволяющий выявлять новые гены и эпигенетические детерминанты, контролирующие нонсенс-супрессию. В данном исследовании при помощи геномного скрининга мы выявили три гена, кодирующих потенциально амилоидогенные белки, сверхэкспрессия которых влияет на супрессорный фенотип в штамме, продуцирующем химерный белок Ар^ир35МС на фоне делеции хромосомной копии гена БиРЗБ, кодирующего фактор терминации трансляции еЯЯЗ. Нами установлено, что гены ЫАБ2, ЫАБ3 и VTS1 участвуют в регуляции нонсенс-супрессии у дрожжей S. cerevisiae.
Ш Ключевые слова: прион; амилоид; дрожжи; NAB2; NAB3; VTS1; Sup35; [ДО/+]; нонсенс-супрессия.
Поступила в редакцию 12.05.2011 Принята к публикации 02.09.2011
выявление генов, кодирующих потенциально амилоидогенные белки, участвующих в регуляции нонсенс-супрессии
у дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE
ВВЕДЕНИЕ
Нонсенс-супрессией называется процесс прочтения стоп-кодонов в качестве значащих, чему способствует, в частности, снижение эффективности терминации трансляции или деградации некоторых мРНК. Нонсенс-супрессия достаточно хорошо изучена у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для которых в настоящее время известен ряд генов-супрессоров, контролирующих данный признак. Среди них гены различных тРНК (Weiss et al., 1987; Ong et al., 1997), гены SUP35 и SUP45 (Инге-Вечтомов, 1964), HAL3, PPZ1 и PPZ2 (Ivanovet al., 2010), UPF1, UPF2 и UPF3 (Ono et al., 2005).
Необходимо отметить, что у дрожжей изучен не только генетический, но и эпигенетический контроль нонсенс-супрессии. Показано, что в регуляции этого признака участвует ряд дрожжевых прионов. Прионами называют белки, способные существовать в двух структурно и функционально отличающихся конформациях, одна из которых обладает инфекционными свойствами. Прио-низация обычно сопровождается формированием упорядоченных обогащенных бета-слоями агрегатов, называемых амилоидами. В настоящее время известны семь дрожжевых белков, способных к прионизации: Sup35, Rnq1, Ure2, Swi1, Cyc8, Mot3 и Sfp1 (Wickner, 1994; Derkatch et al., 1997; Du et al., 2008; Patel et al., 2009; Alberti et al., 2009; Rogoza et al., 2010). Прионные свойства продемонстрированы также для аспарагин-глутамин обогащенного домена белка New1 (Osherovich and Weissman, 2001). Кроме этого, выявлены два прионо-подобных фактора ([Р] и [СЭД+]), не связанных с амилоидогенезом (Roberts and Wickner, 2003; Brown and Lindquist, 2009). Общим свойством амилоидных дрожжевых прионов, в отличие от прионного белка млекопитающих PrP, является обогащенность их структурных белков аспарагином (N) и глутамином (Q) (Yang et al., 2006; Serio et al., 2000). Показано участие в контроле нонсенс-супрессии как минимум трех прионных детерминантов: [PS/+], [P/A+] и [/SP+]. Детерминант [PS/+] является прионной изоформой Sup35, выполняющего функцию фактора терминации трансляции (Zhouravleva et al., 1995), и обладает свойствами доминантного омнипотентного супрессора (Wickner, 1994). Детерминант [P/A+], прионная изоформа Rnq1, непосредственно не регулирует нонсенс-супрессию, однако оказывает опосредованное влияние на этот процесс, вызывая спонтанное возникновение [PS/+] (Derkatch et al., 1997). Детерминант [/SP+], возникающий вследствие прионизации Sfp1, является антисупрессо-ром на фоне комбинации специфических мутантных аллелей SUP35 и SUP45 (Rogoza et al., 2010). Недавно мы выявили новый супрессорный прионоподоб-ный детерминант [AS/+] (Nonsense Suppression Inducer), который имеет особенности, характерные для дрожжевых прионов: он обладает способностью к обратимому изгнанию под действием антиприонного агента хлорида гуанидина, а также на фоне делеции или инактивации шаперона Hsp104, характеризуется доминантным неменделевским типом наследования 4:0 в мейозе и цитоплазма-тической инфекционностью. Таким образом, [AS/+] является новым дрожжевым прионом с неизвестным геном-детерминантом (Saifitdinova et al., 2010). Этот детерминант вызывает омнипотентную нонсенс-супрессию на фоне делеции последовательности, кодирующей N-терминальный домен Sup35, однако не имеет проявления на фоне продукции полноразмерного Sup35 (Saifitdinova et al., 2010). Следовательно, можно констатировать, что делеция SUP35A создает
Таблица 1
использованные в работе штаммы S. cerevisiae
Штамм Генотип Источник
1-1-Д931 MATa sup35A::HIS3* ade1-14** his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289** [pU-Aß-Sup35MC] [NSI+][PIN+]*** Цапонина и др., 2005
4-1-1-Д931 Дериват штамма 1-1-Д931, несущий плазмиду pL-Aß-Sup35MC вместо плазмиды pU-Aß-Sup35MC Saifitdinova et al., 2010
2-4-1-1-Д931 MATa sup35A::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pL-Aß-Sup35MC] [nsr][PIN+] Saifitdinova et al., 2010
1-Д933 MATa sup35A::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aß-Sup35MC] [nsi"][PIN+] Saifitdinova et al., 2010
* — $ир35А::Н^3 — последовательность гена SUP35 замещена на последовательность гена Н^3. ** — Аллель ade1-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trp1-289 — нонсенс-мутацию UAG. *** — [ЛЙ1+] и [Р!У+] — стандартные обозначения дрожжевых прионных детерминантов.
своеобразный «провокационный» генетический фон, позволяющий выявлять новые гены и эпигенетические детерминанты, участвующие в регуляции нонсенс-супрессии.
В данном исследовании проведен геномный скрининг для выявления генов, контролирующих супрессию нонсенс-мутаций на фоне делеции SUP35N. Предложенный подход позволил выявить ряд последовательностей, контролирующих проявление нонсенс-мутаций. В частности, идентифицированы гены, кодирующие потенциально амилоидогенные белки, сверхэкспрессия которых индуцирует супрессорный фенотип.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
штаммы, среды и условия культивирования
микроорганизмов
В работе применяли стандартные методы дрожжевой генетики (Kaiser et al., 1994). Генотипы штаммов дрожжей приведены в таблице 1. Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм Escherichia coli DH5a (Hanahan, 1985). При культивировании E. coli использовали жидкую и твердую среду LB (Sambrook et al., 1989). Дрожжи культивировали при 30 °С на твердой и жидкой среде YAPD, а также на синтетических средах, содержащих необходимые витамины, микроэлементы и аминокислоты (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Для экспрессии генов под контролем регулируемого промотора CUP1 в среды добавляли 150 мкМ CuSO4. Нонсенс-супрессию оценивали по росту штамма на селективной среде без аденина на четвертый день инкубации (Saifitdinova et al., 2010). Для селекции клонов, потерявших плазмиды, несущие ген URA3, использовали минимальную селективную среду с добавлением 1 г/л фтороротовой кислоты (ФОК) (Kaiser et al., 1994).
плазмиды
Все использованные в работе плазмиды содержат дрожжевой и бактериальный ориджины репликации. Многокопийные плазмиды PCUP1-GFP (URA3) и pL-
Aß-Sup35MC, несущие гены GFP и Aß-SUP35MC соответственно под контролем промотора CUP1, получены нами ранее (Рубель и др., 2008; Saifitdinova et al., 2010). Многокопийные плазмиды серии pU-CUP1 (pU-DEF1, pU-NAB2, pU-NAB3, pU-NRP1, pU-PIN3 и pU-VTS1) предназначены для сверхэкспрессии генов DEF1, NAB2, NAB3, NRP1, PIN3 и VTS1. Плазмиды получены путем инсерции ПЦР-фрагментов соответствующих генов (условия ПЦР, матрицы и праймеры описаны в разделе «Молекулярно-биологические методы») в плазмиду PCUP1-GFP (URA3). Инсерция фрагмента производилась по сайтам BamHI и SacII (pU-CUP1-DEF1, pU-CUP1-VTS1 и pU-CUP1-NRP1), BamHI и SacI (pU-CUP1-NAB2 и pU-CUP1-NAB3) или BamHI и NotI (pU-CUP1-PIN3). Плазмиды содержат перечисленные гены под контролем индуцибельного промотора CUP1 , а также гены AmpR и URA3. Наличие вставок требуемых генов подтверждали при помощи секвенирования с использованием праймера CUP1-End.
Для проведения скрининга использована адресная дрожжевая геномная библиотека YSC4613 ("Open Biosystems", EU). Библиотека включает 1588 клонов E. coli, несущих челночный многокопийный вектор pGP564 с уникальными фрагментами генома S. cerevisiae, средним размером 10,8 тысяч пар нуклеотидов и содержащими до 20 открытых рамок считывания. Таким образом, каждый клон адресной библиотеки содержит одну плаз-миду с несколькими генами S. cerevisiae с известной нук-леотидной последовательностью. Вектор pGP564 маркирован геном устойчивости к антибиотику канамицину для селекции в бактериях и геном LEU2, обеспечивающим прототрофность дрожжевых штаммов, содержащих мутацию leu2 на среде без лейцина.
молекулярно-биологические методы
Использованные для конструирования плазмид серии pU-CUP1 последовательности генов DEF1, NAB2, NAB3, NRP1, PIN3 и VTS1 были получены клонированием при помощи ПЦР с геномной ДНК штамма 1-Д933.
Использованные в работе праймеры Таблица 2
Название Последовательность 5'-3'
FChPUF4 CCTCGAAGGAGGATTTGAT
RChPUF4 GAGAATATCCAACTGCTTTTG
FVTS1BAMH1 GAGCGGATCCATGAAACATCCGTATGAGGAATTCC
RVTS1SAC2 CATCCCGCGGTGCAACGTCAAGACAATCAAC
FPIN3BGL2 GAATCCAGATCTTATATGTCTGCTTCATTGATTAA
RPIN3NOT1 GATTAAGCGGCCGCAGAACTTCGTTCAATTTATG
FDEF1BAMH1 TGACGGATCCATGTCTACACAATTTAGG
RDEF1SAC2 ATAAGCCGCGGTGGGAGGTTCTACTTCTC
FNRP1BAMH1 CGTCGGATCCATGCACTATGTGGTACTAGAGC
RNRP1SAC2 CATACCGCGGGCGCACAATTACGTTCTTCAG
FNAB3BAMH1 CAGCGGATCCATGTCAGATGAAAACCATAACAG
RNAB3SAC1 CTACGAGCTCACCGCTATGTCGAATTTATGC
FNAB2BAMH1 ACACGGATCCTATATGTCTCAAGAACAGTACAC
RNAB2SAC1 GCTTCCGAGCTCTCAGTTCATTTCCGTATCTT
RVTS1BAM1 GAATTTGGATCCGCAACGTCAAGACAATCAAC
CUP1-End TCCGCTGAACCGTTCCAG
Последовательности праймеров для ПЦР приведены в таблице 2.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выявление фрагментов дрожжевого генома, мно-гокопийная экспрессия которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [№1-][РШ+] 1-Д933
В данном исследовании нами был проведен геномный скрининг для выявления генов, сверхэкспрессия которых вызывает нонсе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.