ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 420, № 1, с. 134-138
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.151:616-006.04
ОНКОСУПРЕССИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ РНКазы А И ДНКазы I
© 2008 г. О. А. Шкляева, Н. Л. Миронова, Е. М. Малкова, О. С. Таранов, Е. И. Рябчикова, М. А. Зенкова, академик В. В. Власов
Поступило 06.12.2007 г.
Исследована способность РНКазы А и ДНКазы I подавлять рост опухоли и препятствовать ее метастазированию. Показано, что при внутримышечном введении РНКазы А и ДНКазы I в низких дозах мышам линии C57/B1/6J с трансплантированной карциномой легких Льюис, метастази-рующей в легкие, происходит 2-8-кратное уменьшение общей площади метастазов и наблюдаются дистрофические изменения онко-цитов в очагах метастазирования. Под действием РНКазы А одновременно наблюдается угнетение роста первичной опухоли, при этом отсутствует побочное токсическое действие препарата на организм животного. Полученные результаты позволяют предложить РНКазу А и ДНКазу I в качестве агентов адьювантной терапии метастазирующих форм рака.
Несмотря на значительные успехи клинической и экспериментальной онкологии поиск новых подходов к терапии злокачественных новообразований остается актуальной медико-биологической проблемой. Обнаруженное в 50-е годы прошлого века токсическое действие экзогенных рибонуклеаз (РНКаз) на раковые клетки послужило толчком к изучению этих ферментов в качестве противоопухолевых препаратов. Первые эксперименты показали, что РНКаза А не проявляет цитотоксического действия in vitro [1], а in vivo оказывает слабый противоопухолевый эффект [2]. Отсутствие противоопухолевого действия РНКазы А связывали с ее инактивацией под действием внутриклеточного ингибитора ри-бонуклеазы (RI).
Вследствие этого внимание привлекли другие представители семейства РНКазы А - BS-РНКа-за (РНКаза семенников быка) [3], онконаза [4] и конъюгаты РНКазы А с различными молекулами [5], которые проявляли цитотоксическую и противоопухолевую активность, так как не инак-тивировались RI. Было показано, что и BS-РНКаза,
и онконаза оказывают сильный противоопухолевый эффект. Так, конъюгаты онконазы с антителами к CD22 на поверхности B-лимфоцитов в дозах 5-25 мг/кг вызывали торможение развития различного типа лимфом у мышей [4]. BS-РНКа-за в дозе 12.5 мг/кг вызывала подавление роста различного типа раковых опухолей человека у мышей линии nude [3]. Другими словами, в высоких дозах эти ферменты оказывали выраженное противоопухолевое действие, однако при этом наблюдался целый ряд нежелательных побочных эффектов: общее иммуносупрессивное действие и негативное влияние на репродуктивную систему.
По мнению исследователей, механизм токсического действия рибонуклеаз на клетки опухоли связан с деградацией внутриклеточных РНК, а селективность взаимодействия рибонуклеаз с опухолевыми клетками обеспечивается усиленным отрицательным зарядом опухолей за счет анионного фосфатидилсерина, экспонированного на поверхности кровеносных сосудов в опухолях [6].
Действие ДНКазы на опухолевые клетки человека исследовано менее широко. В 60-е годы XX в. на модели спонтанного лимфолейкоза у мышей линии АКР была обнаружена способность ДНКазы I вызывать уменьшение размеров перерожденных лимфатических узлов у больных животных [7]. Возможность подавлять процессы метастазирования с помощью ДНКазы I у мышей была показана на модели опухоли L5178Y-ML, метастазирующей в печень [8]. Однако использование ДНКазы I в качестве агента адьювантной терапии при лечении рака не получило распространения.
В данной работе мы показали, что ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты, способны в низких дозах подавлять рост опухоли и препятствовать ее метастазированию.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование активности РНКазы А и ДНКазы I in vitro. Активность использовавшихся препаратов РНКазы А и ДНКазы I была предварительно оценена в экспериментах in vitro.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
Рис. 1. Гистотопограммы долей легких. Окрашивание гематоксилином и эозином. а - контрольное животное; б - животное, получившее инъекции ДНКазы I в дозе 0.023 мг/кг.
РНКаза А в концентрации 10 9 M расщепляет РНК HIV-1 на 50% за 10 мин инкубации. ДНКаза I в концентрации 10 ед. акт./мл вызывает полную деградацию ДНК плазмиды pHIV-2 за 1 мин инкубации.
Концентрации ферментов РНКазы А - 5 ■ 10-9 -5 ■ 10-7 М и ДНКазы I - 10-1000 ед. акт./мл, при которых наблюдали эффективное расщепление НК-субстратов в экспериментах in vitro, были взяты за основу для определения диапазона концентраций ферментов в экспериментах in vivo. Пересчет молярности РНКазы А в мг/кг массы животного производили, используя молекулярную массу фермента, равную 13700 г/М. Пересчет единиц активности ДНКазы I в мг/кг производили согласно удельной активности препарата: 2155 ед. акт. ДНКазы I на 1 мг фермента. Пересчет активных концентраций ферментов в мг/кг массы животного вычисляли, принимая среднюю массу мыши равной 20 г и объем инъекции 0.1 мл. В результате были использованы следующие диапазоны концентраций ферментов: 3.5 ■ 10-4 - 3.5 ■ 10-2 мг/кг для РНКазы А и 0.023-2.3 мг/кг для ДНКазы I.
Исследование противоопухолевой активности РНКазы А и ДНКазы I. Противоопухолевую и антиметастатическую активности РНКазы А и ДНКазы I in vivo исследовали на самках мышей линии C57B1/6J возрастом 10-11 недель с привитой карциномой Льюис, ме-тастазирующей в легкие. Начиная с восьмого дня после трансплантации опухоли, животные были поделены на группы и получали ежедневные внутримышечные инъекции: группа 1 - физиологический раствор; группа 2 (подгруппы 2-6) -РНКаза А (3.5 ■ 10-4, 7 ■ 10-4, 3.5 ■ 10-3, 7 ■ 10-3 и 3.5 ■ 10-2 мг/кг) в физиологическом растворе; группа 3 (подгруппы 7-11) - ДНКаза I (0.023, 0.115, 0.23, 1.15 и 2.3 мг/кг) в физиологическом растворе. В процессе эксперимента ежедневно проводили измерение объема опухоли.
В начальный период лечения (на десятый день после трансплантации опухоли) размеры опухо-
лей между группами различались слабо. Однако на 16-й день после трансплантации опухоли мы наблюдали существенную (в 1.8 раз) регрессию размеров опухолей в подгруппах, получавших инъекции РНКазы А. При дозах РНКазы А 3.5 ■ ■ 10-4-3.5 ■ 10-2 мг/кг регрессия размера опухолей относительно контроля была существенной и достигала 32% (Р < 0.05). Изменения размеров опухолей в группе, получавшей инъекции ДНКазы I, не имели достоверных отличий от контроля. Статистические сравнения выполняли, используя критерий Стьюдента.
Для изучения влияния инъекций РНКазы А и ДНКазы I на процессы метастазирования после окончания эксперимента легкие у животных были изъяты, зафиксированы в 4%-ном формальдегиде, и исследована их патоморфология. Гематок-силин/эозиновое окрашивание парафиновых срезов легких проведено для образцов из контрольной группы; из подгрупп животных, получавших минимальную (0.023 мг/кг) и максимальную (2.3 мг/кг) дозы ДНКазы I, и из подгруппы, получавшей инъекции РНКазы А в дозе 7 ■ 10-4 мг/кг. На рис. 1 приведены примеры гистологических срезов доли легкого контрольного животного (а) и доли легкого животного, получившего минимальную дозу ДНКазы I 0.023 мг/кг (б).
В подгруппах животных, получавших инъекции ДНКазы I, в очагах метастазирования наблюдались дистрофические изменения онкоцитов: изменялись тинкториальные свойства цитоплазмы, она просветлялась, в ней визуализировались отдельные гранулы; ядра с признаками кариорекси-са. Отличительной чертой действия препарата являлась интенсивная мононуклеарная инфильтрация метастазов и экстравазатов. В подгруппе животных, получавших инъекции РНКазы А в дозе 7 ■ 10-4 мг/кг, также прослеживалось нарастание интенсивности мононуклеарной инфильтрации метастазов и визуализировались выраженные дистрофические изменения опухолевых клеток. Наблюдаемые изменения позволяют предположить,
Площадь метастазов, %
Рис. 2. Уменьшение площади метастазов под действием РНКазы А и ДНКазы I. а - животные: контрольные (1), получавшие инъекции ДНКазы I в дозе 2.3 мг/кг (2), 0.023 мг/кг (3), РНКазы А в дозе 7 • 10-4 мг/кг (4). P < 0.05 (*). б - животные: контрольные (1), получавшие инъекции смеси 1 (ДНКаза I + РНКаза А, 0.023 и 7 • 10-4 мг/кг соответственно (2), смеси 2 (ДНКаза I + РНКаза А, 0.023 и 3.5 • 10-4 мг/кг соответственно) (3). P < 0.01 (**).
что, по всей видимости, в онкоцитах происходит запуск механизмов апоптоза.
Таким образом, при сравнении группы контрольных животных с опухолью Льюис и подгрупп животных, получавших лечение РНКазой А и ДН-Казой I, выявлены признаки индуцированного па-томорфоза метастазов, проявляющиеся в выраженных дистрофических изменениях онкоцитов и усилении мононуклеарной инфильтрации.
Общую площадь метастазов определяли с помощью метода морфометрии. Гистологические образцы были отсканированы с помощью сканера Epson Perfection 2400, с использованием программы Adobe Photoshop C52 был посчитан процент площади метастазов на легочной доле относительно полной площади легочной доли. На рис. 2 приведены данные морфометрического исследования площади метастазов в контрольной группе и подгруппах, получавших лечение ферментами. Процент ингибирования роста метастазов вычисляли как разность средних значений площади метастазов в контроле и в опыте, деленную на среднее значение площади метастазов в контроле (х100). Статистические сравнения выполняли, используя непараметрический критерий Манна-Уитни.
В подгруппах животных, получавших инъекции ДНКазы I в максимальной (2.3 мг/кг) и в минимальной (0.023 мг/кг) дозах, процент торможения роста метастазов составил 35.5 и 45.3% (P < < 0.05) соответственно. В подгруппе животных, получавших инъекции РНКазы А в дозе 7 • 10-4 мг/кг, процент торможения роста метастазов был наибольшим и составил 59% (P < 0.05).
Выявленные структурные изменения метастазов в группах животных, получавших лечение, свидетельствуют о воздействии использованных лекарственных препаратов непосредственно на опухолевые клетки. При этом не выявлено их выраженного воздействия на прилегающие участки респираторной ткани легк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.