РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 246-251
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ОППОЗИТНЫЕ ВАРИАНТЫ АКТИВАЦИИ МАКРОФАГОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ та1-И та2-ЗАВИСИМЫХ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ
© 2009 г. В.О. Ткачев, Н.Н. Вольский, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман,
О.П. Колесникова, В.А. Козлов
ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия Поступила: 02.07.2009. Принята: 05.08.2009
На ранних сроках (0 — 2 недели) после индукции хронической РТПХ, вызванной трансплантацией лимфоидных клеток в полуаллогенной системе ОБЛ/2 ^ (С57Б16хОБЛ/2)Р1 и развивающейся по двум оппозитным вариантам (ТЫ - и ТЬ2-зависимому), отмечено увеличение продукции оксида азота и угнетение активности аргиназы в перитонеальных макрофагах, что свидетельствует об их активации по классическому механизму. На поздних сроках (более 20 недель) ТЬ2-зависимый вариант хронической РТПХ характеризуется альтернативной активацией макрофагов (с высокой активностью аргиназы), тогда как ТЫ-ва-риант — классической активацией (с усилением продукции N0). Полученные данные свидетельствуют о важной роли метаболического статуса макрофагов, тесно связанного с механизмом их активации, в патогенезе РТПХ-индуцированных иммунопатологических состояний.
Ключевые слова: макрофаги, хроническая РТПХ, аргиназа, оксид азота
ВВЕДЕНИЕ
В современной иммунологии сложилась концепция, предусматривающая наличие классического и альтернативного механизмов активации макрофагов, ведущих к их дифференцировке в фенотипически и функционально различные типы клеток (М1- и М2-макрофаги, соответственно). При активации макрофагов их дифференцировка в М1-клетки вызывается, главным образом, провоспалительными цитокинами ТЫ-профиля (в частности, №N7) в сочетании с неспецифическими стимулами, такими, как бактериальные липополисахариды. Классически активированные макрофаги играют важную роль в защите организма от большинства вирусных и бактериальных инфекций, а также противоопухолевом иммунитете [1]. Дифференцировка макрофагов в М2-клетки осуществляется противовоспалительными цитокинами Тк2-профиля (1Ь-4, 1Ь-13 и 1Ь-10), иммунными комплексами, глюкокортикоид-
Адрес: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. E-mail: tkachev victor@mail.ru
ными гормонами и другими агентами. Данная субпопуляция макрофагов обеспечивает фазу разрешения воспалительного процесса и репарацию тканей, стимулирует гуморальный (1Ъ2-зависимый) иммунный ответ [2]. Важным отличительным признаком оппозитных субпопуляций активированных макрофагов являются особенности метаболизма амино-ки слоты Ь-аргинина [3]. М1-клетки характеризуются высокой активностью N0-синтазы и, следовательно, высоким уровнем продукции оксида азота, обусловливающим их ци-тотоксические и цитостатические свойства. В М2-клетках Ь-аргинин метаболизируется преимущественно аргиназой с образованием мочевины, а также Ь-пролина и полиаминов, которые стимулируют клеточную пролиферацию и фиброгенез, что имеет важное значение для процессов репарации [4].
Предполагается наличие функциональной взаимосвязи между вариантами активации макрофагов и ТЫ/1Ъ2-балансом в иммунной системе, однако для выяснения характера и механизма этого взаимодействия необходимо изучение этого феномена в различных экспериментальных моделях. Одной из таких моделей, еще не исследованной в данном отноше-
нии, является реакция трансплантат против хозяина, индуцированная переносом лимфо-идных клеток от мышей линии БВА/2 гибридам первого поколения (С57В1/6хБВА/2)Р1. Ранее нами было показана возможность ее спонтанного развития по двум иммунопатологическим вариантам, связанным с преимущественной активацией ТЫ- или 1Ь2-звена иммунной системы [5 — 7]. Первый вариант (ТЫ-зависимый) характеризуется угнетением гуморальных иммунных реакций, а второй (Тк2-зависимый) сопровождается формированием аутоиммунного иммунокомплексного гломерулонефрита на фоне иммуносупрес-сии. Таким образом, оппозитные варианты развития хронической РТПХ, индуцированной в данной полуаллогенной системе, могут быть использованы в качестве моделей ТЫ - и Тк2-зависимых иммунопатологических состояний.
Исходя из этого, в данной работе исследованы особенности метаболического состояния макрофагов (связанного с механизмом их активации) на различных сроках хронической РТПХ, развивающейся по ТЫ- или Тк2-зави-симому вариантам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. В работе использовали мышей линий DBA/2 и гибридов первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)F1 (B6D2F1), самок, в возрасте 2 — 6 месяцев, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН.
Индукция хронической реакции трансплантат против хозяина и определение ее иммунопатологического варианта
РТПХ индуцировали у мышей путём переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2. Клетки селезёнки вводили реципиентам внутривенно в дозе 65 х 106 клеток двукратно с интервалом в 5 дней [8]. В качестве контроля использовали интактных самок B6D2F1 того же возраста. О развитии гломерулонефрита, характеризующего 1Ь2-зависимый вариант развития РТПХ, судили по появлению стойкой протеинурии (не менее 3 мг/мл в двух последовательных измерениях). Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Coomassie Blue (Loba Feinchemie, Австрия) на
длине волны 570 нм. Калибровочную кривую строили по стандартным растворам БСА (Sigma, США)
Выделение и культивирование резидентных перитонеальных макрофагов
Мышам после декапитации в полость брюшины вводили 10 мл холодной культуральной среды RPMI-1640 (ГНЦ ВБ Вектор) c 1% фе-тальной бычьей сывороткой (FCS; Биолот), через 2 минуты клетки перитонеального экссудата извлекали при помощи шприца. Полученные клетки отмывали центрифугированием и культивировали в 96-луночном планшете (Orange scientific, Бельгия) по 200 х 103 клеток на лунку в течение 2 часов в полной культу-ральной среде, приготовленной на основе RPMI-1640 (без фенолового красного) и содержащей 10% FCS, 15 мМ Hepes (Sigma, США), 0,3% L-глютамина (ГНЦ ВБ Вектор). После этого неприлипающую фракцию удаляли двукратной отмывкой теплой средой RPMI-1640. Полученные таким образом перитонеальные макрофаги культивировали в течение 24 часов (для определения активности аргиназы), либо 48 часов (для определения продукции оксида азота) в полной культуральной среде. Для активации NO-синтазы в начале культивирования добавляли LPS (E. Coli B5:055) в конечной концентрации 10 мкг/мл (Sigma, США) и LPS в сочетании с IFNy. В качестве источника IFNy использовали супернатант смешанной культуры лимфоцитов, полученным стандартным методом [9].
Продукцию оксида азота оценивали по содержанию нитритов в супернатанте клеточных культур [10]. Для этого спустя 48 часов из лунок культурального планшета отбирали по 100 мкл супернатанта и смешивали с равным объемом реактива Грисса (Fluka, Швейцария). Пробы выдерживали в темноте 15 минут, после чего определяли оптическую плотность при длине волны 540 нм.
Активность аргиназы определяли микрометодом по скорости образования мочевины из экзогенного L-аргинина [11]. Для этого макрофаги лизировали 0,1% раствором Triton X100, после чего к 50 мкл лизата добавляли 50 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4) и 10 мкл 50 мМ раствора хлорида марганца. Аргиназу активировали нагреванием на водяной при +57°С в течение 10 минут, добавляли к пробам по 100 мкл 0,5 М раствора L-аргинина и инкубировали их 1 час при +37°С. Реакцию оста-
навливали добавлением H2SO4/H3PO4/H2O (в объемном соотношении 1:3:7). Концентрацию мочевины определяли колориметрически при длине волны 540 нм после добавления 9% спиртового раствора альфа-изонитрозопропиофе-нона (Sigma, США) и нагревания на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Результат выражали в mU активности фермента. За 1 U активности аргиназы принимали количество фермента, синтезирующего 1 ммоль мочевины в минуту.
Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Отличия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05. Результаты на графиках и в таблицах приведены в виде средних величин.
Работа выполнена с использованием технической базы Центра коллективного пользования СО РАМН.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Продукцию оксида азота и активность аргиназы исследовали на 3, 5, 9 и 12 сутки после начала индукции хронической РТПХ. Было установлено, что на 9 сутки, то есть через 48 часов после второй трансплантации полуал-логенных лимфоцитов, достоверно увеличивается как спонтанная, так и LPS- и LPS/IFNy-стимулированная продукция оксида азота макрофагами (Таб. 1). В этот срок впервые уровень спонтанной продукции NO достигает величины, которая может быть достоверно измерена используемым методом. Также возрастает уровень LPS/IFNy-стимулированной продукции NO (на 62% по сравнению с интакт-ными животными), но особенно резко (более чем троекратно) увеличивается его LPS-сти-мулированная продукция. Эти данные можно объяснить изменениями концентраций про- и противовоспалительных цитокинов в
Таблица 1. Продукция оксида азота (в мкМ нитритов) на ранних сроках хронической РТПХ
Стимулятор продукции
Сроки после начала индукции хронической РТПХ (сутки)
NO Контроль 3 5 9 11
— 0 0 0 6* 0
LPS 11,2 14,3 4,9 32,4* 12,8
LPS/IFNy 39,9 60,7 26,5 64,5* 48
Таблица 2. Активность аргиназы (в ти) на ранних сроках развития хронической РТПХ
Сроки после начала индукции хронической РТПХ (сутки)
Контроль 3 5 9 11
580 415 410 390 410
сыворотке крови в процессе развития хронической РТПХ. Согласно данным других авторов, однократный перенос полуаллогенных лимфоидных клеток приводит через 24 — 48 часа к увеличению синтеза провоспалитель-ных цитокинов (1Ь-2 и №N7), после чего их количество в сыворотке крови снижается, тогда как продукция Тк2-ассоциированных цитокинов начинает с этого времени возрастать [12, 13]. Следует отметить, что наблюдаемая нами 3 сутки (48 часов после первого переноса клеток) выраженная тенденция к увеличению LPS- и LPS/IFNy-стимулированной продукции также хорошо согласуется с данными о динамике проду
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.