ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 1, с. 27-31
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 577.21:598.112
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА В ПОПУЛЯЦИЯХ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯЩЕРИЦ Darevskia dahli (сем. Lacertidae) С ПОМОЩЬЮ ЛОКУС-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР
© 2007 г. А. Г. Давоян1' 2, А. В. Асланян2, Ф. Д. Даниелян2, И. С. Даревский3, И. А. Мартиросян1
1 Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; факс: (495) 135-41-05; e-mail: dna@biogen.msk.su 2 Ереванский государственный университет, кафедра зоологии, Ереван 375049; e-mail: lacerta@ysu.am 3 Зоологический институт Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034; факс: (812) 114-04-44; e-mail: dis@zisp.spb.su Поступила в редакцию 04.04.2006 г.
Локус-специфическая ПЦР использована для определения генетического полиморфизма в трех популяциях партеногенетического вида ящериц Darevskia dahli. Анализ проведен на выборке 26 особей по двум (ОАТА)и-содержащим локусам (Du215 и Du281). Обнаружено восемь аллельных вариантов по локусу Du215 и три - по локусу Du281. Показано, что все исследованные особи гетерозиготны по этим локусам. У 12 особей по локусу Du215 обнаружен необычный аллельный вариант, происхождение которого может быть связано с различными типами геномной реорганизации или сегментной дупликации. Выявлены значительные различия по уровню аллельного полиморфизма между исследованными популяциями, что может объясняться различными экологическими условиями обитания популяций, приводящими к накоплению мутаций в некодирующей области генома.
Изучение строения участков генома, содержащих микросателлитные последовательности, представляет особый интерес для партеногенети-ческих видов позвоночных. Микросателлитсо-держащие локусы расположены, как правило, в некодирующей области генома, поэтому с течением времени могут накапливать "нейтральные" мутации, анализ которых, возможно, позволит изучить эволюцию партеновидов. Также парте-ногенетические виды, в нашем случае - однополые виды ящериц рода Darevskia, могут служить модельным объектом для изучения механизмов нестабильности локусов, содержащих микросателлитные кластеры, поскольку у партеновидов отсутствует комбинаторная изменчивость и их геном содержит только накопленные со временем мутации.
Darevskia dahli - один из семи пратеногенети-ческих видов рода Darevskia, обитающий на территории Грузии и Армении, возникший в результате межвидовой гибридизации бисексуальных видов D. portschinskii и D. mixta [1, 2]. Согласно данным митохондриального анализа, "материнским видом" является вид D. mixta [3], что было подтверждено и таксонопринтным методом [4]. "Отцовский вид" был определен с помощью анализа аллозимных локусов [5] и метода полимераз-ной цепной реакции со случайными праймерами [6]. На основании анализа 35 аллозимных локусов в популяциях партеновида D. dahli было выявле-
но пять "аллозимных клонов". Один из них был широко распространен по всему ареалу, а четыре встречались только в некоторых популяциях Армении и были представлены малым числом особей. По 21 аллозимному локусу все особи исследуемого вида были гомозиготами, по 12 - гетеро-зиготами [5]. С помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга было показано, что особи В. ёаИН характеризуются видоспецифическим спектром маркеров и по ряду микросателлитсо-держащих локусов в исследованных популяциях удается выявить значительный уровень генетического полиморфизма [7, 8]. В одной из популяций ("Дилижан", Армения)1 по окраске брюшка было выявлено две морфоформы, одна из которых откладывает меньше яиц и менее устойчива к засухе [5]. Однако обе морфоформы не отличались ни по результатам митохондриального анализа [5], ни по данным ДНК-фингерпринтинга [7]. Ранее нами с помощью локус-специфического ПЦР-анализа был выявлен внутривидовой полиморфизм у партеновида В. unisexualis по двум локусам ядерного генома Ви281 (Ас. № AY442143) и Ви215 (Ас. № AY574978), которые содержали (вАТА)п-мик-росателлитный кластер [9]. Родительские виды партеновидов В. ёаИН и В. unisexualis характери-
1 В связи с ростом населенного пункта "Дилижан" пос. Па-
панино стал окраиной этого населенного пункта. По этой
причине в данной статье названия "Дилижан" и "Папани-но" могут употребляться как синонимичные.
Нуклеотидная последовательность и температура отжига праймеров, использованных для ПЦР-анализа популя-ционных образцов ДНК D. dahli
Локус Ac. № Праймер Нуклеотидная последовательность Ta, °C
Du215 AY574978 F 5' -CAACTAGCAGTAGCTCTCCAGA-3' 58
R 5' -CCAGACAGGCCCCAACTT-3'
Du281 AY442143 F 5' -TTGCTAATCTGAATAACTG-3' 50
R 5' -TCCTGCTGAGAAAGACCA-3'
Примечание. F - прямой праймер, R - обратный праймер.
зуются сходным (а в некоторых случаях идентичным) уровнем генетического разнообразия [10] и часто объединяются в общие филогенетические группы.
В настоящей работе локус-специфический ПЦР-анализ использован для оценки генетического полиморфизма популяций D. dahli, включая различные морфоформы этого вида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Кровь самок D. dahli из природных популяций "Дилижан"2 (13 особей), "Степанаван" (10 особей) и "Шагали" (3 особи) (Армения) консервировали в 0.05 М эДтА рН 8.0 и хранили при +4°С. Образцы ДНК были выделены стандартным фе-нольно-хлороформным методом с использованием протеиназы К [11]. В качестве праймеров для монолокусного ПЦР-анализа были использованы пары праймеров для амплификации локусов Du215 и Du281 [9]. Последовательность праймеров и температура отжига приведены в таблице. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси (состав смеси: 1 х буфер для Taq-полимера-зы ("Бионем", Россия), 2 мМ MgCl2, 0.25 мкМ каждого dNTP, 10 мкМ каждого праймера, 0.8 ед. Taq-полимеразы ("Бионем", Россия), 20 нг ДНК, в четырехканальном ДНК-амплификаторе "Тер-цик" (ТП4-ПЦР-01) при следующих температурных режимах: денатурация при 94°C - 3 мин, амплификация в течение 30 циклов: 94°C - 1 мин, Ta°C - 40 с (см. таблицу), 72°C - 40 с, последний цикл - 5 мин при 72°C. Наличие (вАТА)и-микро-сателлита в PCR-продуктах было подтверждено следующим образом: 1/5 часть продуктов амплификации фракционировали в 1%-ном агарозном геле и проводили блот-гибридизацию по Саузерну с (GATA)4 олигонуклеотидным зондом, меченым по 3'-концу в прямой киназной реакции с использованием полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 ("Fermentas") согласно протоколу производителя. Оставшуюся часть продуктов амплификации фракционировали в 8%-ном нативном полиакриламид-
2 Названия популяций соответствуют названиям населенных пунктов, в окрестностях которых производился сбор материала.
ном геле с последующей визуализацией бромистым этидием.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты ПЦР-амплификации ДНК особей партеновида В. ёакк представлены на рисунке. Как видно на позиции а рисунка по локусу Ви281 все особи партеновида В. ёакк являются гетеро-зиготами, размер продуктов амплификации составляет ~205 и ~220 пн, межпопуляционных различий практически не наблюдается. Лишь у одной особи из популяции "Степанаван" встречается изменение подвижности одного из фрагментов (на рисунке обозначен цифрой 3).
По локусу Ви215 (рисунок, б) все особи изучаемого однополого вида также являются гетерози-готами, размер ПЦР-продуктов варьировал в пределах 220-250 пн. У 12 особей наблюдалось появление дополнительного продукта амплификации размером ~195 пн. В популяции "Дилижан" (рисунок, б, дорожки 1-13) было выявлено четыре отличающихся по электрофоретической подвижности варианта (обозначены цифрами 5, 6, 7, 8). В популяции "Шагали" (дорожки 14-16) обнаружено также четыре различных по подвижности в геле продукта амплификации (обозначены цифрами 4,5, 7, 8). Наиболее гетерогенной по локусу Ви215 оказалась популяция "Степанаван" (дорожки 17-26): было выявлено семь различающихся по электрофоретической подвижности ПЦР-продукта (обозначены цифрами 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8).
Таким образом, в отличие от В. unisexualis [9] у В. ёакИ уровень внутривидового полиморфизма по локусу Ви215 оказался гораздо выше, чем по локусу Ви281: по локусу Ви215 у В. ёакк удалось выявить не менее 8 аллельных вариантов, а по локусу Ви281 - три аллельных варианта. При этом обнаружено, что популяция "Степанаван" является более гетерогенной по сравнению с двумя другими. Для обоих локусов наибольшее число вариантов было выявлено именно в этой популяции, что может объясняться различными экологическими условиями обитания популяций, приводящими к накоплению мутаций в некодирую-
пн 300
1 2 3 4 5 6 7 8 91011 1213 1415 161718 19 202122 23 2425 26
1 1
200
В# W M ь J
2 3
пн
250
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
5 55 453323 322412
7 67 777767676777
8
8
8
8
8
Электрофорез в 8%-ном нативном ПААГ продуктов амплификации ДНК особей D. dahli. а - локус Du281, дорожки 1-13 - популяция "Дилижан", 14-16 - "Шагали", 17-26 - "Степанаван". В качестве маркера молекулярного веса использовали Ladder 100 bp+ ("Fermentas") с шагом 100 пн; б - локус Du215, дорожки 1-12 - популяция "Дилижан", 1315 - "Шагали", 16-25 - "Степанаван". В качестве маркера молекулярного веса использовали Ladder 50 bp ("Fermentas") с шагом 50 пн.
а
щей области генома. Возможно также, что популяция "Степанаван" является более древней по сравнению с другими популяциями D. dahli.
В некоторых случаях высокий уровень гетерогенности у однополых видов может объясняться множественностью происхождения [12]. Однако, согласно данным митохондриального и аллозим-ного анализов, "преклон", ставший предковым для партеновида D. dahli, возник на ограниченной территории и в результате единичного акта гибридизации между малым числом родительских особей [5], что привело к низкому уровню кло-нального разнообразия. Для отдельных популяций нельзя, конечно, исключить эффекта "бутылочного горлышка", в результате которого также происходит уменьшение генетического разнообразия.
По-видимому, основной вклад в определенный нами внутривидовой полиморфизм D. dahli внесли спонтанные мутации в микросателлитсодер-жащих локусах ядерного генома. В частности, небольшие различия по электрофоретической подвижности ПЦР-продуктов отдельных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.